Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Summary

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Abstract

Mitocondrias del músculo esquelético disfuncionales juegan un papel en el metabolismo alterado observado con el envejecimiento, la obesidad y la diabetes tipo II. Ensayos respirométricos mitocondrial de preparaciones mitocondriales aislados permiten la evaluación de la función mitocondrial, así como la determinación del mecanismo (s) de acción de los fármacos y las proteínas que modulan el metabolismo. Procedimientos de aislamiento actuales requieren a menudo grandes cantidades de tejido para producir las mitocondrias de alta calidad necesarias para los ensayos de respirométricos. Los métodos presentados en este documento describen cómo de alta calidad mitocondrias purificadas (~ 450 g) se puede aislar a partir de cantidades mínimas (~ de 75-100 mg) de músculo esquelético de ratón para su uso en mediciones respiratorias de alto rendimiento. Se determinó que nuestro método de aislamiento produce 92,5 ± 2,0% mitocondrias intactas midiendo la actividad de la citrato sintasa espectrofotometría. Además, el análisis Western blot en mitocondrias aisladas resultó en la expresión débil del cytosoproteína lic, GAPDH, y la expresión robusta de la proteína mitocondrial, COXIV. La ausencia de una banda de GAPDH prominente en las mitocondrias aisladas es indicativo de poca contaminación de fuentes no mitocondriales durante el procedimiento de aislamiento. Lo más importante, la medición de la tasa de consumo de O ₂ con tecnología basada en micro-placa y la determinación de la relación del control respiratorio (RCR) para los ensayos de respirométricos acoplado muestra altamente acoplado (RCR;> 6 para todos los ensayos) y las mitocondrias funcionales. En conclusión, la adición de una etapa de picar carne separada y reduciendo significativamente impulsado por motor de velocidad homogeneización de un método reportado previamente ha permitido el aislamiento de alta calidad y mitocondrias purificada a partir de cantidades más pequeñas de ratón músculo esquelético que da como resultado en las mitocondrias altamente acoplados que respiran con alta función durante ensayos respirometirc basado en una microplaca.

Introduction

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis^1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes^3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies^3-5.

Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species^6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays.

Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several µg per well⁸. Therefore, we present a modification of previously published methods⁷ to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O₂ consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research^9,10.

Protocol

Los estudios en animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión en el Instituto Politécnico de Virginia y la Universidad Estatal. 1. Configuración (Tiempo: ~ 45 min) Tiendas Descongele de 0,25% de tripsina, Aislamiento Buffer de mitocondrias (IBM) 1 y IBM2 en un baño de agua a 37 ° C. Enjuague la cristalería y los instrumentos de disección en etanol al 70%, seguido de agua de alta pureza. Pr…

Representative Results

La actividad de la citrato sintasa sirve como medida para la integridad de la membrana desde la citrato sintasa se ​​encuentra en la membrana mitocondrial interna, y por lo tanto no debe estar presente en las suspensiones de las mitocondrias con membranas intactas. La figura 1 representa la actividad de la citrato sintasa en muestras no se sonicaron mitocondriales en comparación con sonicado muestras de la misma aislamiento. Sonicando los resultados mitocondrias en un aumento estadísticamente sign…

Discussion

Los métodos presentados en este documento proporcionan una descripción detallada de un procedimiento de aislamiento mitocondrial a partir de cantidades mínimas (~ de 75-100 mg) de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento de aislamiento es capaz de producir de alto funcionamiento, las mitocondrias pura (~ 450 g) como lo demuestra O ₂ tasas de consumo, valores RCR, máxima actividad de la citrato sintasa y de expresión de proteínas de inmunotransferencia. Es importante destacar que las mitocondr…

Materials

Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Acid Free- BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771	N/A
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750	N/A
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched	Sigma Aldrich	238651	N/A
Single Edge Razor Blades	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers	Fisher Scientific	352360	N/A
Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	1861284	N/A
1.5mL microcentrifuge tubes with screw cap	Thermo Scientific	3474	N/A
Zirconium Oxide beads	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH antibody (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
Anti- COXIV antibody	Cell Signaling	4844s	Any mitochondrial inner membrane protein will suffice
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N/A
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	N/A
Pyruvic Acid, 98%	Sigma Aldrich	107360	Store at 4°C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S9512	Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95%	Sigma Aldrich	M6413	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Store at -20°C
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Store at -20°C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Store at 2-8°C
phenylhydrazone
≥98% (TLC), powder [FCCP]
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Store at -20°C
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Store at -20°C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Store at room temperature