Isolering av mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Microandnings Mätningar

Summary

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Abstract

Dysfunktionella skelettmuskel mitokondrier spela en roll i förändrad ämnesomsättning observerats med åldrandet, övervikt och diabetes typ II. Mitokondriella respirometric analyser från isolerade mitokondriella förberedelser gör det möjligt att bedöma mitokondriefunktion, samt fastställandet av den mekanism (er) av verkan av läkemedel och proteiner som modulerar ämnesomsättningen. Nuvarande isoleringsförfaranden kräver ofta stora mängder av vävnad för att ge hög kvalitet mitokondrier som är nödvändiga för respirometric analyser. De metoder som presenteras här beskriva hur hög kvalitet renade mitokondrier (~ 450 mikrogram) kan isoleras från minimala mängder (~ 75-100 mg) av mus skelettmuskulatur för användning i hög kapacitet andnings mätningar. Vi bestämde att vår isolering metod ger 92,5 ± 2,0% intakt mitokondrier genom att mäta citrat syntasaktivitet spektrofotometriskt. Dessutom Western blot-analys i isolerad mitokondrier resulterade i svag expression av cytosoLic protein, GAPDH och robust uttryck för den mitokondriella proteinet, COXIV. Avsaknaden av en framstående GAPDH band i isolerade mitokondrier tyder på liten förorening från icke-mitokondriella källor under isoleringsförfarandet. Viktigast, mätning av O ₂ förbrukning med mikroplatta baserad teknik och bestämma andningskontrollförhållandet (RCR) för kopplade respirometric analyser visar starkt kopplade (RCR,> 6 för alla analyser) och funktionella mitokondrier. Sammanfattningsvis, tillsatsen av ett separat hacksteg och avsevärt minska motordriven homogenisering hastigheten på en tidigare rapporterad metod har tillåtit isolering av hög kvalitet och renade mitokondrier från mindre mängder av mus-skelettmuskel som resulterar i starkt kopplade mitokondrier som andas med hög funktion under mikro baserad respirometirc analyser.

Introduction

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis^1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes^3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies^3-5.

Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species^6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays.

Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several µg per well⁸. Therefore, we present a modification of previously published methods⁷ to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O₂ consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research^9,10.

Protocol

Djurstudier genomfördes under en godkänt protokoll av Institutional Animal Care och använda kommittén vid Virginia Polytechnic Institute och State University. 1. Setup (Tid: ~ 45 min) Tina frysta förråd av 0,25% trypsin, isoleringsbuffert för Mitokondrier (IBM) 1 och IBM2 i en 37 ° C vattenbad. Skölj glas och dissekera instrument i 70% etanol följt av vatten med hög renhet. Förbered 0,05% trypsin lösning från 0,25% trypsin lager genom att späda u…

Representative Results

Citrat syntasaktivitet tjänar som ett mått på membranintegritet, eftersom citratsyntas ligger i det inre mitokondriemembranet, och bör därför inte förekomma i suspensioner av mitokondrier med oskadade hinnor. Figur 1 visar citrat syntasaktivitet i icke-sonikerad mitokondriella prover jämfört med sonikerades prover från samma isolering. Sonikering av mitokondrier resulterar i en statistiskt signifikant ökning i citrat syntasaktivitet (P <0,01). Viktigt var intakt 92,5 ± 2,0% av mitokondrie…

Discussion

De metoder som presenteras här ger en detaljerad beskrivning av en mitokondriell isoleringsförfarande från minimala mängder (~ 75-100 mg) av mus skelettmuskulaturen. Denna isoleringsförfarandet kan ge högfungerande, rena mitokondrier (~ 450 mikrogram) som framgår av O ₂ konsumtionspriser, RCR värden, maximal citratsyntas aktivitet och proteinuttryck från immunoblotting. Viktigt kan mitokondrierna isolerade från detta förfarande användas för flera respirometirc analyser med mikrobaserad O _2</…

Materials

Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Acid Free- BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771	N/A
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750	N/A
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched	Sigma Aldrich	238651	N/A
Single Edge Razor Blades	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers	Fisher Scientific	352360	N/A
Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	1861284	N/A
1.5mL microcentrifuge tubes with screw cap	Thermo Scientific	3474	N/A
Zirconium Oxide beads	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH antibody (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
Anti- COXIV antibody	Cell Signaling	4844s	Any mitochondrial inner membrane protein will suffice
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N/A
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	N/A
Pyruvic Acid, 98%	Sigma Aldrich	107360	Store at 4°C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S9512	Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95%	Sigma Aldrich	M6413	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Store at -20°C
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Store at -20°C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Store at 2-8°C
phenylhydrazone
≥98% (TLC), powder [FCCP]
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Store at -20°C
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Store at -20°C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Store at room temperature