At studere mikrobielle samfund<em> In vivo</em>: En model af Host-medieret samspil mellem<em> Candida albicans</em> Og<em> Pseudomonas aeruginosa</em> I luftvejene
Summary
While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.
Abstract
At studere vært-patogen interaktion gør os i stand til at forstå de underliggende mekanismer i patogenicitet under mikrobiel infektion. Prognosen for værten afhænger inddragelse af respons en tilpasset immunrespons mod patogenet 1. Immunrespons er kompleks og resultater fra samspillet af patogener og flere immune eller ikke-immune cellulære typer 2. In vitro-undersøgelser kan ikke karakterisere disse interaktioner og fokusere på celle-patogen interaktioner. Desuden i luftvejene 3, især hos patienter med suppurativ kronisk lungesygdom eller i mekanisk ventilerede patienter, polymikrobielle samfund er til stede og komplicere værtspatogene interaktion. Pseudomonas aeruginosa og Candida albicans er begge problem patogener 4, ofte isoleret fra tracheobronchial prøver, og associeret til alvorlige infektioner, især i intensiv afdeling 5. Mikrobielle interaktionerblevet rapporteret mellem disse patogener in vitro, men den kliniske effekt af disse interaktioner er fortsat uklart 6. At studere samspillet mellem C. Albicans og P. aeruginosa, en murin model af C. albicans airways kolonisering, efterfulgt af et P. aeruginosa- medieret akut lungeinfektion blev udført.
Introduction
Dyremodeller, især mus, er blevet udbredt anvendt til at undersøge immunreaktioner mod patogener. Selv medfødte og erhvervede immunitet variere mellem gnavere og mennesker 7, letheden i avl og udvikling af knockouts for mange gener, at mus en fremragende model til at studere immune 8 reaktioner. Det immunrespons er kompleks og et resultat af samspillet af et patogen, beboeren mikrobielle flora og flere immune (lymfocytter, neutrofile, makrofager) og ikke-immune (epitelceller, endotelceller) cellulære typer 2. In vitro-undersøgelser tillader ikke observere disse komplekse samspil og hovedsagelig fokuserer på unikke celle-patogen interaktioner. Mens dyremodeller skal anvendes med forsigtighed og er begrænset til meget specifikke og relevante spørgsmål, musemodeller giver et godt indblik i immunrespons pattedyr in vivo og kan rette dele af vigtige kliniske 7 spørgsmål.
<p class="jove_content"> i luftvejene, det mikrobielle miljø er kompleks knytte en lang række forskellige mikroorganismer 6. Mens hvad der udgør en "normal" luftvejs microbiome mangler at blive fastlagt, hjemmehørende samfund er ofte polymikrobielle, og stammer fra forskellige økologiske kilder. Patienter med suppurativ kronisk lungesygdom (cystisk fibrose, bronchectasis) eller mekanisk ventilerede patienter udviser en bestemt flora grund kolonisering af luftvejene ved miljømæssigt erhvervede mikroorganismer 9. Pseudomonas aeruginosa og Candida albicans er både problemet patogener 5, ofte isoleret sammen fra tracheobronchial prøver , og ansvarlig for alvorlig opportunistisk infektion hos disse patienter, især i intensivafdelingen (ICU) 4.Isolering af disse mikroorganismer under akut lungebetændelse hos ICU resulterer i antimikrobiel behandling mod P. aeruginosa but gær er normalt ikke anses for patogene på dette site 5. In vitro interaktioner mellem P. aeruginosa og C. albicans er blevet bredt rapporteret og viste, at disse mikroorganismer kan påvirke væksten og overlevelsen af hinanden, men undersøgelser kunne ikke konkludere, om tilstedeværelsen af C. albicans er skadelig eller gavnlig for værten 10. Musemodeller blev udviklet for at løse dette relevans P. aeruginosa og C. albicans in vivo, men interaktionen mellem mikroorganismer var ikke det centrale punkt. Faktisk blev den model, etableret for at vurdere inddragelsen af C. albicans i immunrespons vært, og resultat.
En tidligere model oprettet af Roux et al allerede brugt en indledende kolonisering med C. albicans efterfulgt af en akut lungeinfektion fremkaldt af P. aeruginosa. Ved hjælp af deres model, forfatterne fundet en skadelig rolle prior C. albicans Kolonisering 11. Men Roux et al anvendte en høj belastning med C. albicans i deres model med 2 x 10 6 CFU / mus i løbet af 3 dage i træk. Vi etablerede en 4-dages-model C. albicans luftveje kolonisering, eller i det mindste persistens uden lungeskader, I denne model C. albicans blev hentet op til 4 dage efter en enkelt instillation af 10 5 CFU pr mus (figur 2B) 12,13. Efter 4 dage blev observeret nogen tegn på inflammatorisk celle rekruttering, inflammatorisk cytokinproduktion eller epitelial skader. Ved 24 – 48 timer, på toppen tilstedeværelsen af C. albicans, selv om et cellulært og cytokin medfødte immunreaktion blev observeret, var der ingen tegn på lungeskader. Overraskende mus således koloniseret med C. albicans 48 timer før intranasal instillation af P. aeruginosa havde svækket infektion sammenlignet med mus med P. aeruginosa-infektion alene. jegndeed, udviste mus mindre lungeskade og nedsat bakteriebyrden 12,13.
Adskillige hypoteser kunne forklare denne gavnlige effekt af tidligere kolonisering med C. albicans på P. aeruginosa medieret akut lungeinfektion. Først en interspecies krydstale involverer hver mikroorganismer quorum-sensing systemer, den homoserinelactone-baserede P. aeruginosa systemet og farnesol-baserede C. albicans systemet, blev evalueret. For det andet, C. albicans fungere som "attrap" target for P. aeruginosa aflede patogenet fra lungeepitelceller blev undersøgt. Begge hypoteser blev ugyldige (upublicerede data). Den tredje hypotese var, at en "priming" af medfødte immunsystem ved C. albicans er ansvarlig for en forbedret efterfølgende medfødt respons mod P. aeruginosa. Denne sidste hypotese blev bekræftet. Faktisk C. albicans kolonisering førte til en grunding af medfødte immunitet through IL-22, hovedsageligt udskilles med medfødte lymfoide celler, hvilket resulterer i øget bakteriel clearance og reducerede lungeskader 12.
Afslutningsvis, værten er en central aktør i samspillet mellem mikroorganismer modulerer medfødte immunreaktion og involverer forskellige inflammatoriske celletyper. Mens disse komplekse immune interaktioner kan dissekeres in vitro de indledende hypoteser kan kun gives ved passende in vivo modeller. Følgende protokol giver et eksempel på in vivo-undersøgelse af værtsmedierede patogen interaktion, der kan tilpasses til andre mikroorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dyremodeller, især pattedyr, er nyttige til at belyse komplekse mekanismer værtspatogene interaktion på områderne immunitet. Selvfølgelig behovet for information kun hos dyremodeller skal være af afgørende betydning; ellers skal anvendelsen af dyr blive erstattet af in vitro-modeller. Denne dyremodel illustrerer den indsigt, som kun kan leveres af en dyremodel Da interaktionen mellem patogener medieres af en multi-komponent værtsrespons. Mus i øjeblikket anvendes til at studere denne vært-patogen inte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the “Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française” (SPILF).
Materials
| Sevorane, Sevoflurane | Abott | 05458-02 | 250 mL plastic bottle |
| Fluorescence Reader Mithras LB940 | Berthold Technologies | reference in first column | no comment |
| Bromo-cresol purple agar | Biomerieux | 43021 | x20 per unit |
| Pentobarbital sodique 5,47% | CEVA | 6742145 | 100 mL plastic bottle |
| 2-headed valve | Distrimed | 92831 | no comment |
| Sterile inoculation loop 10 µL | Dutscher | 10175 | x1000 conditioning |
| Insuline syringes 1 mL | Dutscher | 30003 | per 100 conditioning |
| 2 positions Culture tube 8 mL | Dutscher | 64300 | no comment |
| Ultrospec 10 | General Electric life sciences | 80-2116-30 | no comment |
| Hemolysis tubes 13 x 75 mm | Gosselin | W1773X | per 100 |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | Life technologies | 10010023 | packaged in 500 mL |
| amikacin 1g | Mylan | 62516778 | per 10 |
| Heparin 10 000 UI in 2 mL | Pan pharma | 9128701 | x 10 per unit |
| RAL 555 coloration kit | RAL Diagnostics | 361550 | 3 flacons of 100 mL |
| 1,5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 55.526.006 | x 1000 |
| Transparent 300 µL 96-well plate | Sarstedt | 82 1581500 | no comment |
| Yest-peptone-Dextrose Broth | Sigma | 95763 | in powder |
| FITC-albumin | Sigma | A9771 | in powder |
| Luria Bertani Broth | Sigma | L3022 | in powder |
| 25-gauge needle | Terumo or unisharp | A231 | x100 conditioning |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | no comment |
Riferimenti
- Casadevall, A., Pirofski, L. -. A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
- Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
- Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
- Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
- Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
- Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
- Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
- Faure, E., Mear, J. -. B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
