Studere mikrobielle samfunn<em> I Vivo</em>: En modell av Host-mediert samhandling mellom<em> Candida albicans</em> Og<em> Pseudomonas aeruginosa</em> I Airways
Summary
While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.
Abstract
Studere vert-patogen interaksjon gjør oss i stand til å forstå de underliggende mekanismene for patogenitet under mikrobiell infeksjon. Prognose av vert avhenger av involvering av en tilpasset immunrespons mot en patogen. Immunrespons er kompleks og resultater fra samspillet av patogener og flere immun eller ikke-immune cellulære typer 2. In vitro-studier kan ikke karakterisere disse samhandling og fokus på celle-patogen interaksjoner. Videre, i luftveiene 3, særlig hos pasienter med purulent kronisk lungesykdom eller i mekanisk ventilerte pasienter, polymikrobielle samfunn er til stede og komplisere vert-patogen interaksjoner. Pseudomonas aeruginosa og Candida albicans er begge problem patogener 4, ofte isolert fra tracheobronchial prøver, og knyttet til alvorlige infeksjoner, spesielt i intensivavdeling 5. Mikrobielle interaksjoner harrapportert mellom disse patogener in vitro, men den kliniske betydningen av disse interaksjonene er fortsatt uklart 6. For å studere samspillet mellom C. Albicans og P. aeruginosa, en murine modell av C. albicans airways kolonisering, etterfulgt av en P. aeruginosa- mediert akutt lungeinfeksjon ble utført.
Introduction
Dyremodeller, spesielt mus, har vært i utstrakt bruk for å oppdage immunresponser mot patogener. Selv om medfødt og ervervet immunitet variere mellom gnagere og mennesker 7, letthet i avl og utvikling av knockouts for mange gener, lage mus en utmerket modell for å studere immunresponser 8. Immunresponsen er kompleks og resultater fra samspillet av et patogen, bosatt mikrobielle flora og flere immun (lymfocytter, nøytrofile, makrofager) og ikke-immune (epitelceller, endotelceller) cellulære typer 2. In vitro studier tillater ikke observere disse komplekse interaksjoner og hovedsakelig fokusere på unike celle-patogen interaksjoner. Mens dyremodeller må brukes med forsiktighet og begrenset til svært spesifikke og relevante spørsmål, musemodeller gir et godt innblikk i pattedyr immunrespons in vivo og kan ta opp deler av viktige kliniske spørsmål 7.
<p class="jove_content"> I luftveiene, er det mikrobielle samfunnet kompleks forbinde et stort antall forskjellige mikroorganismer 6. Mens hva som utgjør en "normal" airway mikrobiomer gjenstår å fastslå, bosatt samfunn er ofte en blandingsflora bestående og stammer fra ulike økologiske kilder. Pasienter med purulent kronisk lungesykdom (cystisk fibrose, bronchectasis) eller mekanisk ventilerte pasienter utviser en spesiell flora på grunn av koloniseringen av luftveiene ved miljø ervervet mikroorganismer 9. Pseudomonas aeruginosa og Candida albicans er både problem patogener 5, ofte isolert sammen fra tracheobronchial prøver og ansvarlig for alvorlig opportunistisk infeksjon hos disse pasientene, spesielt i intensivavdeling (ICU) 4.Isolering av disse mikroorganismene under akutt lungebetennelse hos intensiv resultater i anti-mikrobiell behandling mot P. aeruginosa but gjær er vanligvis ikke ansett patogene på dette nettstedet fem. In vitro interaksjoner mellom P. aeruginosa og C. albicans har vært mye rapportert og viste at disse mikroorganismer kan påvirke vekst og overlevelse av hverandre, men undersøkelser kunne konkludere om tilstedeværelsen av C. albicans er skadelig eller gunstig for verten 10. Musemodeller ble utviklet for å løse dette relevansen av P. aeruginosa og C. albicans in vivo, men samspillet mellom mikroorganismer var ikke det sentrale punkt. Faktisk ble modellen etablert for å vurdere involvering av C. albicans i vertens immunrespons, og utfallet.
En tidligere modell etablert av Roux et al allerede brukt en innledende kolonisering med C. albicans etterfulgt av en akutt lungeinfeksjon indusert av P. aeruginosa. Ved hjelp av deres modell, fant forfatterne en skadelig rolle prior C. albicans Colonization 11. Imidlertid Roux et al anvendes en høy belastning av C. albicans i deres modell med 2 x 10 6 CFU / mus i løpet av 3 dager. Vi har etablert en 4-dagers modell av C. albicans luftveier kolonisering, eller i det minste varighet uten lungeskade, I denne modellen C. albicans ble hentet opp til 4 dager etter en enkel instillering av 10 5 CFU per mus (figur 2B) 12,13. Etter 4 dager ble ingen tegn på inflammatorisk cellerekruttering, inflammatorisk cytokinproduksjon eller epitelskade observert. På 24 – 48 timer, på toppen nærvær av C. albicans, selv om en mobil og cytokin medfødte immunrespons ble observert, var det ingen tegn på lungeskade. Overraskende, mus og dermed kolonisert med C. albicans 48 timer før intranasal innføring av P. aeruginosa hadde svekket infeksjon sammenlignet med mus med P. aeruginosa infeksjon alene. jegndeed, mus viste mindre lungeskade og redusert bakteriemengden 12,13.
Flere hypoteser kan forklare dette gunstig effekt av tidligere kolonisering med C. albicans på P. aeruginosa formidlet akutt lungeinfeksjon. Først en arts cross-talk involverer hver mikroorganismer quorum-sensing systemer, den homoserinelactone baserte P. aeruginosa system og farnesol baserte C. albicans system, ble evaluert. Sekund, C. albicans opptre som en "lokkedue" target for P. aeruginosa avlede patogenet fra lunge epitelceller ble studert. Begge hypoteser ble ugyldiggjort (upubliserte data). Den tredje hypotese var at for en "priming" av medfødte immunsystemet av C. albicans ansvarlig for en forbedret påfølgende medfødt respons mot P. aeruginosa. Denne siste hypotesen ble bekreftet. Faktisk C. albicans kolonisering førte til en grunning av medfødt immunitet igjennomgh IL-22, hovedsakelig utskilt av medfødte lymfoidceller, noe som resulterer i økt bakteriell clearance og redusert lungeskade 12.
I konklusjonen, er det vert en sentral aktør i samspillet mellom mikroorganismer moduler det medfødte immunrespons og involverer ulike betennelsescelletyper. Mens disse komplekse immuninteraksjonene kan dissekert in vitro den innledende hypoteser kan kun gis ved hjelp av passende in vivo-modeller. Den følgende protokollen gir et eksempel på en in vivo studie av vert-mediert patogen interaksjon som kan være tilpasset til andre mikroorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dyremodeller, spesielt pattedyr, er nyttige for å klargjøre kompliserte mekanismer for vert-patogen interaksjon innen immunitet. Selvfølgelig, behovet for informasjon oppnåelig bare fra dyremodeller må være avgjørende; ellers må bruke dyr erstattes av in vitro-modeller. Denne dyremodell illustrerer den innsikt som bare kan leveres av en dyremodell fordi interaksjonen mellom patogener er mediert av en flerkomponentvertsrespons. Mus i dag brukes til å studere dette host-patogen interaksjoner er unge voks…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the “Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française” (SPILF).
Materials
| Sevorane, Sevoflurane | Abott | 05458-02 | 250 mL plastic bottle |
| Fluorescence Reader Mithras LB940 | Berthold Technologies | reference in first column | no comment |
| Bromo-cresol purple agar | Biomerieux | 43021 | x20 per unit |
| Pentobarbital sodique 5,47% | CEVA | 6742145 | 100 mL plastic bottle |
| 2-headed valve | Distrimed | 92831 | no comment |
| Sterile inoculation loop 10 µL | Dutscher | 10175 | x1000 conditioning |
| Insuline syringes 1 mL | Dutscher | 30003 | per 100 conditioning |
| 2 positions Culture tube 8 mL | Dutscher | 64300 | no comment |
| Ultrospec 10 | General Electric life sciences | 80-2116-30 | no comment |
| Hemolysis tubes 13 x 75 mm | Gosselin | W1773X | per 100 |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | Life technologies | 10010023 | packaged in 500 mL |
| amikacin 1g | Mylan | 62516778 | per 10 |
| Heparin 10 000 UI in 2 mL | Pan pharma | 9128701 | x 10 per unit |
| RAL 555 coloration kit | RAL Diagnostics | 361550 | 3 flacons of 100 mL |
| 1,5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 55.526.006 | x 1000 |
| Transparent 300 µL 96-well plate | Sarstedt | 82 1581500 | no comment |
| Yest-peptone-Dextrose Broth | Sigma | 95763 | in powder |
| FITC-albumin | Sigma | A9771 | in powder |
| Luria Bertani Broth | Sigma | L3022 | in powder |
| 25-gauge needle | Terumo or unisharp | A231 | x100 conditioning |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | no comment |
Riferimenti
- Casadevall, A., Pirofski, L. -. A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
- Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
- Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
- Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
- Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
- Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
- Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
- Faure, E., Mear, J. -. B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
