血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル
Summary
このプロトコルは、疾患の病理における細胞応答を決定するのを助けるために、インビトロで生理学的または病理学的な血流を複製します。血液ポンプの下流ダンピング室の圧力を導入することにより、脈管構造を横切る血流が血管内皮または模倣共培養の単層上で要約し、課すことができます。
Abstract
血管疾患は、米国内の死亡の一般的な原因です。ここで、我々は、血管疾患の病理に向けて流動力学の寄与を調べるための方法を提示します。壁の補強、瘢痕化、またはすべての流体の流量に影響を与える可能性があり、部分的狭窄、及び拍動流、または拍動指数の大きさにしばしば存在不健康な動脈。様々な流れ条件の複製は、血液ポンプの下流室を減衰流れ圧力を調整する結果です。閉じたフローシステム内の空気の導入は、ポンプからの脈動圧力を吸収する圧縮可能なメディアを可能にし、したがって、拍動指数を変化させます。本明細書に記載される方法は、単純に、高度に制御入力、および容易に測定結果を、再生されます。いくつかの制限は、システムで近似され、複雑な生理的なパルス波形のレクリエーションです。内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞は、血流THRの影響を受けます動脈ウワーッ。血流の動的成分は、心拍出量および動脈壁のコンプライアンスによって決定されます。流動力学の血管細胞メカノトランスダクションは、サイトカイン放出および動脈内の細胞型の間のクロストークをトリガすることができます。血管細胞の共培養は、血管壁との機械的シグナルに対する血管応答における細胞間相互作用を反映して、より正確な画像です。流れの動的平均（または安定した）コンポーネントに対する細胞応答を含む流動力学の寄与は、したがって、疾患の病状および治療有効性を決定する上で重要な測定基準です。 in vitroでの共培養モデルを導入し、圧力がシミュレートされた心拍出量を生成する血液ポンプの下流に減衰を通して、種々の動脈疾患の病状を調査することができます。
Introduction
心血管疾患の罹患率は、不健康な血管系に起因する多くは、アメリカで最大です。健康な動脈は、内皮細胞（EC）の単層でコーティングされたソフト腔表面に、弾性組織で構成されています。動脈流は、正の平均流量で振動波の関数としてモデル化することができます。拍動指数（PI）は振動の大きさの商と平均流（。。PI =（最大-最小）/平均値 ）で、1変数血管の弾力性とin vitroでモデル化された2動脈の弾力性は、フローのストレージ上で重要です。収縮期圧の下で拡張する心臓収縮のエネルギー、および血流PIの調節に重要な役割を果たしています。心臓が一貫、拍動、体積流量を維持するので、動脈の拡張は、流速、せん断応力、及びPIを減少させることにより流動性を高め、断面積を増大させます。弾力性に頻繁に、不健康な動脈存在変更またはコンプライアンス、血管リモデリングから補強、瘢痕組織または石灰化3、4が表示されます。加えて、新生内膜過形成（NIH）、5瘤および高血圧6および血管線維症4のような他の血管障害は、血管の直径を収縮することができます。しかし、現在の薬物治療、および血管疾患の治療装置は、多くの場合、多くの場合、血管の形態及び特性の変化によって複雑になる血管疾患における血管壁コンプライアンスまたは血流力学の重要性を無視します。どちらのバルーン血管形成術やステント留置術は、壁の弾力性7の合併症に答えます。したがって、血液の in vitroモデルは、動脈疾患と治療に起因する疾患の病理と治療の将来の有効性を検討する上で重要であるが流れます。本明細書において、我々はpathol血管疾患における細胞応答を決定するように設計生理学的および病理学的血流を複製する方法を記載オギース。流体の流れは、血管系内のすべてのセルに影響を与え、血管の健康に重要な機械的な信号である血管壁、でせん断応力が発生します。流体せん断のための血管内皮上のいくつかの機械式センサは内皮mechanosensing 8のための最近の研究で示さ一次繊毛を含む、同定されています。内皮細胞の活性及び形態は、流れの速度、方向、および脈動の影響を受けます。また、平滑筋細胞（SMC）移動は、間質液9を介して低速の流れのメカノ信号によって影響を受けることができ、また、流れおよびサイトカインを介して流量信号のメカノトランスダクションするためにそれらの応答を介して内皮細胞からのパラクリンシグナリングを通じてことができ10を解放します 。 「用量」の平均せん断、PIの依存性、およびパラクリンシグナル伝達はまた、相互に依存する場合があります。単層培養で変化 "投与"と流体せん断に対する血管細胞応答のこの目的のために、決意またはin vitroでの共培養は、血管リモデリングに機械的な洞察を提供し、病気や治療の予測を向上させることができます。この実験で使用されるフローシステムは、血液ポンプ、空気タンク、唯一実験中に使用される下流の流量計、下流の細胞培養、パラレルプレートフローチャンバー、およびメディアリザーバを減衰上流の流れから成ります。以下のような血流変数の制御は、流量平均、分当たりのビート、及びPIは、流量制御、パルス周波数、圧力減衰の導入によって達成され得ます。拍動血液ポンプは、体積流量、およびパルス周波数を意味するように直接関連して、制御されたストロークの周波数で、可変ストローク変位を用意しています。流れ回路内の空気タンクの導入は流れ振動の大きさを低減し、圧力減衰を可能にします。減衰チャンバ内の空気が流れ波から過剰な圧力があることをできるように、圧縮可能である一方でメディアは、非圧縮性流体であります空気圧縮により吸収されます。メディア比への空気は多くの減衰がどのように発生するかを制御することができます。幅50mmによって長さが75ミリメートルカスタム細胞培養フローチャンバーは、アクリルから作成されました。流れは、入口ポートを通って入り、入口マニホルドを通じて膨張し、フローチャンバーの全体一貫した流れを提供します。同様の流れと構造は、チャンバ出口に存在します。細胞は、官能化スライドガラス上に播種し、続いてフローチャンバーに取り付けられています。これは、簡単に研究した後に検索された大規模な集団を可能にします。共培養実験は、サイトカイン/フロー輸送を可能にしながら、培養の間、細胞間の接触を排除するために、多孔性ポリカーボネート膜を使用することができます。このシステムは、以前に病的に高いPI疾患に対する細胞応答を調査するため、10、高PIフローおよび内皮単層培養およびEC / SMC共培養1への影響をモデル化するために使用されてきました。これらのフローコンをモデル化するために使用するプロトコルを記述することによりditionsは、我々は、細胞応答への流れ信号の寄与を決定する際に他の人を支援したいと考えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、in vitroでの拍動流を再生する方法を記載し、そして疾患の病理に流れ状態の寄与を決定するのに役立つ最初の工程であってもよいです。このプロトコルを使用して、以前の研究では、流れ状態は、血管炎症反応に寄与する発見した。さらに1、10、このプロトコルは、経験豊富な研究室のために意図されています。このように、いずれも深流体力学にお…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、AHA（WTに13GRNT16990019）とNHLBI（WTにHL097246とHL119371）などの資金源を承認したいと思います。
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
Riferimenti
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