This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.
Nylig iPSCs har tiltrukket seg oppmerksomhet som en ny kilde til celler for regenerativ behandling. Selv om den første metoden for å generere iPSCs stolt på dermale fibroblaster innhentet av invasiv biopsi og retroviral genomisk innsetting av transgener, har det vært mange forsøk på å unngå disse ulempene. Humane perifere T-celler er en unik cellekilde for å generere iPSCs. iPSCs avledet fra T-celler inneholder rearrangementer av T-cellereseptoren (TCR) gener og er en kilde for antigen-spesifikke T-celler. I tillegg, har T-celle-reseptor-omleiring i genomet potensiale til å merke de enkelte cellelinjer og skille mellom transplanterte og donorceller. For sikker klinisk anvendelse av iPSCs, er det viktig å minimalisere risikoen for å utsette nylig genererte iPSCs for skadelige stoffer. Selv om føtalt bovint serum og mateceller har vært avgjørende for pluripotent stamcelle kultur, er det foretrukket å fjerne dem fra kultursystem for å redusere risikoenuforutsigbar patogenitet. For å løse dette, har vi etablert en protokoll for å generere iPSCs fra humane perifere T-celler ved hjelp av Sendai virus for å redusere risikoen for å utsette iPSCs til udefinerte patogener. Selv om håndtering Sendai virus krever utstyr med riktig biosikkerhetsnivå, Sendai virus infiserer aktiverte T-celler uten genom innsetting, men med høy effektivitet. I denne protokollen demonstrerer vi generering av iPSCs fra humane perifere T-celler i matefrie betingelser ved hjelp av en kombinasjon av aktiverte T-cellekultur og Sendai-virus.
iPSCs har vakt betydelig oppmerksomhet som en banebrytende kilde til celler for regenerativ medisin 1-3. Hittil har ulike metoder for å generere iPSCs blitt rapportert 4,5. Blant disse, iPSCs generert fra humane T-celler har vært av spesiell interesse på grunn av de mindre-invasiv metode for celleprøver 6-8. I tillegg iPSCs avledet fra T-celler inneholder rearrangementer av T-cellereseptoren (TCR) genet, og er således en kilde for antigen-spesifikke T-celler 9,10. Derfor generere T-celle avledet iPSCs trygt er nyttig for framdrift regenerativ medisin.
Denne metoden er basert på konseptet av å redusere risikoen for uforutsigbar patogenitet. For sikker klinisk anvendelse av iPSCs er det viktig for å redusere risikoen for eksponering for patogener 11. Tidligere i mange kultursystemer av pluripotente stamceller, har føtalt bovint serum og mateceller vært brukt som vesentlig reagenss 12. Imidlertid er fjernelse av begge disse reagenser fra dyrkningssystem som foretrekkes for IPSC generering for å redusere risikoen for uforutsigbar patogenitet.
I tillegg har denne fremgangsmåte den fordel at man unngår invasiv celleprøver fra pasienter og arbeidskrevende fremstilling av feeder-celler. Fordi T-celle-avledet iPSCs allerede har vært brukt med hell i sykdoms forskning 13,14, er denne metoden også anvendelig og nyttig for å generere sykdomsspesifikke iPSCs fra pasienter.
Blant T-celle reprogrammerings-metoder, ved hjelp av Sendai-virus (SeV) vektor som et gen kjøretøy er en metode som kan generere iPSCs med høy virkningsgrad 7,16. I tillegg, fordi SeV er et enkelt-trådet RNA-virus, og ikke trenger en DNA-fase for replikasjon, dens anvendelse i IPSC generasjon unngår å bryte vertsgenomet 17-19. Derfor har vi etablert protokoller for å generere iPSCs fra humane perifere T-celler i serum-free og mater frie forhold ved hjelp av en kombinasjon av matrigel, mTeSR medium, og Sev vektorer.
We describe a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells in serum-free and feeder-free conditions using a combination of matrigel, mTeSR medium, and SeV vectors. For clinical applications of iPSCs, it is important to have a protocol for stably generating iPSCs and a less-invasive method for cell sampling. Although generating iPSCs with the combination of matrigel and mTeSR medium showed lower reprogramming efficiency than that with knockout serum replacement (KSR) medium and feeder-cells, this combination achieves stable generation of iPSCs from donors16. Stable iPSC generation and less-invasive cell sampling has the advantage of being able to increase the number of donors for iPSC generation.
SeV vectors, a minus-strand RNA virus, is not integrated into the host genome. Therefore the risks of tumorigenesis can be avoided at the step of reprogramming factor induction20-24. Additionally, the feeder-free conditions, which use a combination of defined culture medium and matrigel instead of a feeder layer, make it possible to minimize the potential risks of exposure to unknown exogenous factors. The fusion of these techniques provides a less invasive and safer iPSC technology for regenerative medicine16.
Important steps in this protocol are the step of activating human T cells (Step 1) and infecting them with SeV vectors (Step 2). When no ESC-like colony is obtained in the culture dish at an optimal time after SeV infection, the following should be considered. First, the confluency of the mononuclear cells before T cell activation may not be appropriate because optimal activation of T cells is critical for SeV infection25,26. Too high a density of mononuclear cells leads to cell death, interfering with the proper activation of T cells. Too low a density of mononuclear cells also disturbs the proper activation and proliferation of T cells. Therefore, the confluency of mononuclear cells should be checked and adjusted accordingly. Second, the dosage of SeV vectors may not be sufficient. The induction efficiency of iPSC colonies depends on the dosage of the virus6. If no ESC-like colony is observed after SeV infection, the option of increasing the virus dosage up to an MOI of 15-20 should be considered. If signs of iPSC colony differentiation are observed, the frequency at which medium is changed may be increased up to every other day, or to every day when colonies are larger.
The limitation in this protocol consists of this method not being virus free. Although SeV for cell reprogramming is commercially available with ease, users need to prepare equipment according to the appropriate biosafety level. As another method for generating integration-free iPSCs, episomal vectors have been used until now27-29. Although episomal vectors can be used with equipment with a lower level of biosafety, episomal vectors might insert into the host genome at extremely low rates. Therefore, additional checks are required to confirm the disappearance of transgenes, as when using SeV.
There is another limitation in that this technique is not absolutely free from animal-derived products. Some substrates, such as matrigel, anti-CD3 mAb, dissociation solution and SeV solution are derived from animal products and are therefore associated with a risk of transferring xenogeneic pathogens. However, the reduction of animal-derived substrates in the culture system is meaningful for the clinical application of iPSC technology due to the lower risk.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, og Rei Ohno fra Keio University School of Medicine for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble delvis finansiert av en R & D Systems støtteprogram for å akselerere den praktiske bruken av helseforskningsresultater, og Highway Program for realisering av Regenerative Medicine.
Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
KBM502 medium | KOHJIN BIO | 16025020 | Warm in 37 ℃ water bath before use |
Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | Thaw completely at 4℃ overnight and dilute it 50 times with Dulbecco's Modified Eagle's Medium before coating culture dishes |
mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
15ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
50ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |