Kvantificering af Colon stamcelle Mutationer

Summary

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Abstract

Evnen til at måle stamceller mutationer er et kraftfuldt værktøj til at kvantificere i en kritisk cellepopulation, hvis og i hvilket omfang, kan en kemisk fremkalde mutationer, der potentielt føre til kræft. Anvendelsen af et enzymatisk assay til at kvantificere stamceller mutationer i X-bundet glucose-6-phosphat-dehydrogenase-genet er tidligere blevet rapporteret. ¹ Denne metode kræver fremstillingen af frosne sektioner og inkubering af snit væv med en reaktionsblanding, der giver et blå farve, hvis cellerne producerer funktionelle glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PD) enzym. Hvis ikke, cellerne synes hvidlig. Vi har ændret reaktionsblandingen under anvendelse Optimal Cutting Temperatur Forbindelse (OLT) medium i stedet for polyvinylalkohol. Dette letter pH-måling, øger solubilisering af G6PD farvning komponenter og begrænser diffusion af G6PD enzymet. For at vise, at en mutation fandt sted i en stamcelle, skal hele krypten mangler G6PD enzymatiskaktivitet. Kun hvis en stamcelle huser en fænotypisk G6PD mutation vil alle afkommet i krypten mangler G6PD enzymatisk aktivitet. At identificere krypter med en stamcelle mutation blev fire på hinanden følgende tilstødende frosne sektioner (A-niveau) skåret på 7 um tykkelser. Denne fremgangsmåde til fremstilling af tilstødende udskæringer giver konformation, at en krypt var fuldt muteret eftersom den samme muterede krypt vil blive observeret i tilstødende sektioner. Dias med vævsprøver, der var mere end 50 um fra hinanden var rede til at vurdere alt> 10 ⁴ krypter pr mus. Mutationsfrekvensen er antallet af observerede muterede (hvid) krypter ÷ antallet af vildtype (blå) krypter i en behandlingsgruppe.

Introduction

Colon cancer menes at involvere udsættelse for miljømæssige midler og kostkomponenter, der kan beskadige DNA og producere aktiverende mutationer i somatiske onkogener (f.eks ß-catenin) eller inaktiverende mutationer i tumorsuppressorgener (f.eks APC). Det antages, at disse kritiske mutationer forekommer i colon stamceller. På grund af den unikke krypt arkitektur tyktarmsepitelet, er det muligt at måle stamceller mutationer i tyktarmen efter eksponering dyr for kemikalier er forbundet med colon carcinogenese. Flere X-bundet enzymer kan tjene som indikatorer for mutationer, der forekommer i stamceller, som mutationerne vil være til stede i alle celler inden for en krypt.

Tidligere blev en procedure offentliggjort påviser, at kemikalier, der fremkalder colontumorer i mus også genereret somatiske stamceller mutationer i colon via analyse af mutationer i X-bundet glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PD) genet. ^1-3Fremgangsmåden kvantificerer forekomsten af ​​tilfældige mutationer i somatiske colon stamceller uden selektionstryk. Denne procedure indebærer produktionen af ​​ufikserede frosne kolon afsnit fra behandlede og kontrol mus og identificering af krypter blottet for celler, der producerer funktionelle G6PD aktivitet. Disse muterede krypter, som synes hvid, viser, at mutationen opstod i en stamcelle, der gav anledning til afkom også huser en muteret G6PD-gen. I den enzymatiske assay kan G6PD muterede krypter ikke oxidere glucose-6-phosphat, som er nødvendig til reduktion af nitro blue tetrazolium (NBT). Når G6PD enzymet er funktionelt, er NBT i farvningen blandingen reduceret til uopløseligt formazan bundfald og, akkumulering ved placeringen af ​​enzymet og "farvning" celler blå. Celler, som er G6PD mutanter forbliver hvidlig i modsætning til blåfarvet vildtype krypter. Denne metode måler mutationer, der har en "nul" fænotype. Fordi enzymes, såsom G6PD, kan diffundere ud af cellerne på en ikke-fikserede vævssnit om sektionerne anbringes i en vandig opløsning, er det nødvendigt at stabilisere enzymet i vævssnittene, der skal analyseres. ⁴ Stabiliseringen af enzymet i Vævet må ikke interferere med diffusionen af ​​små molekyler, der er nødvendige reagens for G6PD enzymatiske reaktion.

Vi har lavet en række væsentlige ændringer i den oprindelige procedure. Mediet til den kritiske enzymatiske farvning er ændret fra polyvinylalkohol til Optimal Cutting Temperatur Forbindelse (OLT), hvilket letter pH kontrol og solubilisering af de komponenter, der anvendes i assayet. Farvningen udføres under anvendelse af 0,4 – 0,5 ml brønde fremstillet af stål skiver, således at hver vævssnit fik det samme volumen af ​​G6PD reaktionsblandingen. En procedure blev udviklet for at estimere antallet af krypter i en sektion, der afbildes giver en stor prøveudtagning af colonvæv uden atmanuelt ud> 10 ⁵ krypter for hver colon. Analysen af ​​tilstødende 7 um vævssnit giver visualisering af en mutant krypt på mere end én slide, hvilket reducerer potentielle farvning artefakter. Disse ændringer gøre proceduren mere effektiv og reproducerbar.

Ved anvendelse af denne reviderede protokol, har vi kvantificeret mutationsfrekvensen i colon stamceller efter eksponering af C57BL / 6-mus til azoxymethan, et velkendt carcinogen colon hos gnavere. ^5-7

Protocol

De eksperimentelle procedurer og etisk behandling af dyr blev godkendt af University of Pittsburgh IACUC (protokol # 1104674). 1. Fremstilling af G6PD Farvning Blanding BEMÆRK: Sørg for, at den endelige koncentration af hver reagenser er som følger; 5 mM glucose-6-phosphat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0,35 mM 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfat (MMPMS) og 0,8 mM NBT. 1,8,9 For hvert reagens startkoncentrationen blev udledt for en 40 ml slutvolumen. Opl?…

Representative Results

Evnen til at måle colon stamceller mutationer hos dyr giver en unik måde at korrelere mutationer til kræft induktion. Normalt er det antaget, at den kritiske trin i carcinogenese involverer aktiverende mutationer i onkogener og / eller inaktivering af mutationer i tumorsuppressorgener. Vi injicerede C57BL / 6-mus med 200 pi PBS eller 10 mg / kg AOM i 200 pi PBS. AOM er en kendt colon kræftfremkaldende. 5-7 til 90 dage koloner blev analyseret for stamcelle mutationer. Denne gang er forpligtet til at tillad…

Discussion

Ofte genotoksisk virkning af en forbindelse bestemmes af dets evne til at modificere DNA. Dette gøres normalt ved at isolere vævet og måle det globale niveau af DNA-addukter. For AOM, vil det indebære kvantificering O ⁶ -methylguanine addukter i tyktarmen. Ved hjælp af denne metode på skader inden for specifikke celletyper, såsom i stamceller niche, er tabt. Desuden er en DNA-adduktet er ikke det samme som en mutation idet kun en lille delmængde af addukter sidst omdannes til faste mutationer. ^12…

Materials

reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room