Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

Summary

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Abstract

A capacidade de medir mutações de células-tronco é uma ferramenta poderosa para quantificar em uma população de células crítico se, e em que medida, um produto químico pode induzir mutações que potencialmente levam ao câncer. O uso de um ensaio enzimático para a determinação de mutações de células estaminais no gene da desidrogenase de glicose-6-fosfato ligado ao X foi previamente relatada. ¹ Este método requer a preparação de secções congeladas e incubação do tecido seccionado com uma mistura de reacção que produz um cor azul, se as células de produzir uma enzima funcional da desidrogenase glicose-6-fosfato (G6PD). Se não, as células parecem esbranquiçado. Modificou-se a mistura de reacção óptima utilizando o Composto Temperatura de corte (OCT) forma em lugar de álcool de polivinilo. Isto facilita a medição de pH, aumenta a solubilização dos componentes de coloração G6PD e restringe a difusão da enzima G6PD. Para demonstrar que a mutação ocorreu em uma célula estaminal, toda a cripta tem falta de G6PD enzimáticaactividade. Somente se uma célula-tronco abriga uma mutação G6PD fenotípica serão todos da descendência na cripta falta atividade enzimática da G6PD. Para identificar criptas com uma mutação de células-tronco, quatro cortes congelados adjacentes consecutivos (um nível) foram cortados em 7 mm espessura. Esta abordagem de fazer cortes adjacentes conformação que proporciona uma cripta foi completamente mutado desde o mesmo cripta mutado será observado nas secções adjacentes. As lâminas com amostras de tecido que eram mais do que 50 mm de intervalo, foram preparados para avaliar um total de> 10 ⁴ criptas por rato. A frequência de mutação é o número de mutantes (branco) criptas ÷ observados pelo número de tipo selvagem (azul) criptas em um grupo de tratamento.

Introduction

O cancro do cólon é pensado para envolver exposição a agentes ambientais e componentes da dieta que podem danificar DNA e produzir mutações ativadoras somáticas em oncogenes (por exemplo, ß-catenina) ou inativação de mutações em genes supressores de tumores (por exemplo, a APC). Supõe-se que estas mutações ocorrem em críticos células estaminais do cólon. Devido à arquitectura única cripta do epitélio do cólon, é possível medir as mutações de células estaminais no cólon após a exposição dos animais a produtos químicos associados com a carcinogénese do cólon. Várias enzimas ligadas ao cromossoma X pode servir como indicadores de mutações que ocorrem em células estaminais, como as mutações vão estar presentes em todas as células dentro de um cripta.

Anteriormente, foi publicado um procedimento demonstrando que os produtos químicos que induzem tumores do cólon em ratos também gerado mutações somáticas de células estaminais no cólon através de análise de mutações em glicose-6-fosfato desidrogenase ligada ao cromossoma X do gene (G6PD) ^1-3.O método quantifica a incidência de mutações somáticas aleatórios em células estaminais do cólon sem qualquer pressão selectiva. O procedimento envolve a produção de secções de cólon congelados não corrigidos de camundongos tratados e de controlo ea identificação das criptas desprovidas de células que produzem atividade G6PD funcional. Estes criptas mutadas, que aparecem branco, indicam que a mutação ocorreu em uma célula estaminal que deu origem a progénie também albergar um gene G6PD mutado. No ensaio enzimático, G6PD criptas mutante deficiente não pode oxidar a glicose-6-fosfato, o qual é necessário para a redução de nitro azul de tetrazólio (NBT). Quando a enzima é funcional em G6PD, o NBT na mistura corante é reduzida a formazano insolúvel e precipitados, acumulando no local da enzima e células "azuis" de coloração. As células que são mutantes G6PD permanecem esbranquiçada em contraste com corados com Azul criptas do tipo selvagem. Este método mede a mutações que têm um fenótipo "nulo". Porque enZymes, tais como G6PD, pode difundir para fora das células sobre uma secção de tecido não fixado se as secções são colocadas numa solução aquosa, que é necessário para estabilizar a enzima nas secções de tecido a serem analisadas. ⁴ A estabilização da enzima na tecido não deve interferir com a difusão de moléculas pequenas de reagentes necessários para a reacção enzimática de G6PD.

Fizemos uma série de mudanças significativas para o processo inicial. O meio para a coloração enzimática crítico foi alterado de álcool polivinílico óptima para o Composto Temperatura de corte (OCT), o que facilita o controlo do pH e a solubilização dos componentes utilizados no ensaio. A coloração é realizada usando 0,4 – 0,5 ml poços feitas de anilhas de aço de modo a que cada secção de tecido recebeu o mesmo volume da mistura de reacção de G6PD. Um procedimento foi desenvolvido para estimar o número de criptas em uma secção trabalhada que fornece uma grande amostragem de tecido do cólon sem terpara contar manualmente> 10 ⁵ para cada criptas do cólon. A análise de 7 uM secções de tecido adjacentes proporciona a visualização de uma cripta mutante em mais de uma corrediça, o que reduz os potenciais artefactos de coloração. Estas alterações tornam o procedimento mais eficiente e reprodutível.

Usando este protocolo revisto, temos quantificada a frequência de mutação em células estaminais do cólon após a exposição de ratinhos C57BL / 6 para azoximetano, um carcinogéneo cólon bem conhecido em roedores. ^5-7

Protocol

Os procedimentos experimentais e tratamento ético dos animais foi aprovado pela Universidade de Pittsburgh IACUC (protocolo nº 1104674). 1. Preparação de G6PD Coloração Mistura NOTA: Certifique-se de que a concentração final de cada um dos reagentes é a seguinte; 5 mM de glicose-6-fosfato (G6P); NADP 2 mM, 5 mM de MgCl2, 0,35 mM de 1-metoxi-5-methylphenazinium sulfato de metilo (MMPMS) e 0,8 mM de NBT 1,8,9 Para cada reagente a concentração inicial foi …

Representative Results

A capacidade de medir mutações de células-tronco de cólon em animais oferece uma maneira única de correlacionar mutações para indução de cancro. Normalmente, presume-se que o passo crítico na carcinogénese envolve a activação de mutações em oncogenes e / ou inactivação de mutações em genes supressores de tumores. Nós injectados ratinhos C57BL / 6 com 200 ul de PBS ou 10 mg / kg OMA em 200 ul de PBS. OMA é uma substância cancerígena conhecida cólon. 5-7 Aos 90 dias os dois pontos foram …

Discussion

Muitas vezes a efeitos genotóxicos de um composto é determinada pela sua capacidade de modificar o ADN. Isso normalmente é feito pelo isolamento do tecido e medindo o nível global do adutos de DNA. Para AOM, isso envolveria quantificar O ⁶ -metilguanina adutos no cólon. Usando esta abordagem informações sobre os danos dentro tipos celulares específicos, tais como no nicho de células estaminais, é perdido. Além disso, um produto de adição de ADN não é o mesmo que uma mutação uma vez que apenas…

Materials

reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room