We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.
Vi har utviklet en protokoll for å forbedre strøm embryoid Body (EB) kulturen som tillater studiet av selv-organisering, symmetri bryte, aksial forlengelse og celle skjebne spesifisering ved bruk av aggregater av mus embryonale stamceller (mESCs) i suspensjonskultur. Små mengder mESCs aggregeres i basal medium i 48 timer i ikke-vev-kultur-behandlet, U-bunnet 96-brønners plater, hvoretter de er i stand til å svare på eksperimentelle signaler. Etter behandling, disse aggregatene begynner å vise tegn til polarisert genekspresjon og gradvis endre sin morfologi fra en sfærisk masse av celler til en langstrakt, velorganisert struktur i fravær av eksterne signaler asymmetri. Disse strukturene er ikke bare i stand til å vise markører for de tre bakterie lag, men aktivt viser gastrulation-lignende bevegelser, dokumentert av en retnings forskyvning av individuelle celler fra aggregatet, som i avgjørende grad skjer på en region av den langstrakte struktur. Dette protocol gir en detaljert metode for reproduserbar dannelsen av disse aggregatene, deres stimulering med signaler som Wnt / β-catenin aktivering og BMP hemming og deres analyse av enkelt tid-punkt eller time-lapse fluorescerende mikroskopi. I tillegg beskriver vi endringer til dagens hel-mount museembryo fargings prosedyrer for immunocytokjemisk analyse av spesifikke markører innenfor faste aggregater. Endringene i morfologi, genekspresjon og lengden av aggregatene kan kvantitativt målt, og gir informasjon om hvordan signaler kan endre aksiale skjebner. Det er tenkt at dette systemet kan brukes både til studiet av tidlige utviklings hendelser som aksial utvikling og organisering, og i videre forstand, prosesser av selvorganisering og celle beslutninger. Det kan også tilveiebringe en passende nisje for generering av celletyper som er tilstede i embryo som er uoppnåelig fra konvensjonell adherent kultur som ryggmarg og motoriske neuroner.
Studien og forståelse av celle-skjebne beslutninger tidlig pattedyr utvikling kan gjøre bruk av kulturer av embryonale stamceller (ESCs), klonale populasjoner avledet fra blastocysts som har muligheten til å selv fornye og differensiere til alle celletyper i en organisme ie., de er pluripotent 1,2. Selv om disse kulturene har vært og fortsetter å være nyttig for forståelsen av den molekylære basis for celle-fate beslutninger, er de ikke i stand til å gjengi noen av de romlige arrangementer og globale oppførsel som genereres i embryoer under gastrulation. I embryo, prosessen med gastrulation forvandler et enkelt epitellaget inn i de tre forskjellige bakterie lag og begaver embryoet med en åpen anteroposteriore organisasjon 3-5. Forsøk på å rekapitulere disse hendelsene ex vivo har vært basert på generering av tredimensjonale aggregater av ESCs, referert til som embryoide legemer (EBS), og underkaste dem to differensiering forhold 6,7. Disse aggregater kan lokket til å differensiere til mange forskjellige celletyper, hvorav noen er enten ute av stand til å bli oppnådd eller indusert med lav effektivitet i heft kultur eller kan ikke produseres i det hele tatt, f.eks. Blod, 8 og 9 ur kjønnsceller. En begrensning i bruken av EBS er imidlertid at de ikke er i stand til å vise den morfogenetiske oppførsel, bakterie lag fordeling eller aksial organisasjon som er viktige egenskaper for utvikling av embryo, noe som resulterer i romlig uorden 6,10. I en rapport, behandling av EBS med Wnt fører til en svak polarisering i genuttrykk i noen aggregater, men ingen klar morphogenesis er observert syv. I nyere rapporter, EBS som er blitt dyrket i lengre tid utvikle fremre strukturer som netthinne, cortex og indre øret sensoriske celler, noe som etterligner deres embryoniske motparter, men utvikles uten sammenheng med en aksial organization 11-13.
En rapport fra Marikawa 14 et al., Mens de arbeider med aggregater av mus P19 Embryo karsinom (EC) celler dannet av hengende dråpe-metoden, rapporterte fremveksten av langstrakte strukturer av mesodermal opprinnelse minner om forlengelsene som blir observert med exogastrulae i amfibier og kråkebolle embryoer og Keller eksplantater 15-18. Ettersom dette ikke hadde blitt observert med mus embryonale stamceller (mESCs), forsøkte vi å gjenskape problemet observert med P19 EC celler ved hjelp av aggregater av mESCs 19 og vi rapporterer kultur forhold som fører til deres symmetri bryte og aksial forlengelse. En viktig forskjell fra arbeidet med P19 celler er at samlings protokoll som er beskrevet her blir utført i en 96-brønns plate, lik den som er beskrevet av Eiraku et al. 20, i stedet for å henge dråper. Denne endringen førte til økt effektivitet i form av samlede utvinning og i beggeintra- og inter-eksperimentell reproduserbarhet. Viktigere, opprettholde aggregater i enkelte brønner sikrer at fusjon mellom aggregater (vanlig når sammenslåing aggregater fra hengende dråper) forekommer ikke. I tillegg har en viktig funksjon i protokollen er 24 timers eksponering for GSK3p inhibitor CHI99021 (Chi), en potent aktivator av Wnt / β-catenin signale, etter aggregering.
Metoden er beskrevet her gir et grunnlag for å forstå prosessene i selvorganisering, aksial organisasjon og bakterie lag spesifikasjon i kultur, slik at slutninger gjøres om aksial utvikling in vivo 19,21. Av disse grunner metoden har potensial til å tillate detaljert mekanistisk analyse av prosesser som kan være vanskelige å studere i embryo. Videre er en potensiell anvendelse i produksjon av vev og organer som ikke er lett tilgjengelige i vedheftende kulturen på grunn av mangelen på en strukturert cellulær nisje såsomryggmarg forløpere 21 og motoriske nevroner. Tredimensjonal aggregat kulturen har en fysisk struktur og signal miljø som er ikke oppnås ved konvensjonelle metoder, som fører til en ny tilnærming for avledning av embryonale linjene i et romlig organisert måte.
Teknikken er beskrevet i dette manuskriptet effektivt og reproduserbart genererer aggregater av mus embryonale stamceller (mESCs) at skjermen organisert symmetri-breaking og forlengelse 19, som kombinerer både hengende dråpe kultur beskrevet av Marikawa et al. 14 og EB formasjon. Disse aggregatene går på å utvikle aksiale forlengelser, supplerer eksisterende metoder for generering av fremre organer fra ES-celler som optiske kopper 11 og hjernebarken 13, og inneholder celler med identiteten til tre-bakterie lag som viser prosesser som ligner på dem i løpet gastrulation som for eksempel rask celle bevegelse 19,21.
Det er interessant å spekulere på arten av symmetrien brytende arrangement, ettersom det forekommer i fravær av eksterne mønster vev og zygotiske asymmetri pekepinner 19. Den spontane dannelse av en rudimentær akse kunne oppstå fra pre-eksisterende heterogeneities i startkultur av celler, som danner grunnlag for utvikling av asymmetri. Faktisk populasjoner av celler dyrket i ESLIF betingelser vise en blanding av selvpolerende og differensierende celler, kan de relative andeler av som varierer fra en aggregert til en annen. Videre forarbeid i vårt laboratorium tyder på at aggregater fra en helt pluripotent populasjon av celler viser forsinket utvikling og defekter i mønster, noe som tyder på en rolle for heterogenitet i organisert mønster formasjon (DA Turner & A. Martinez Arias, som forberedelse). Det er også verdt å vurdere som et reaksjons-diffusjon mekanismen kan danne et mønster, med diffusjon av en inhibitor bort fra overflaten av aggregatet. Warmflash et al. 41 tyder på at en slik mekanisme kan være ansvarlig for å utvikle radial asymmetri i tilhenger kultur, noe som gjør det til en mulig kandidat for mønster i tre dimensjoner.
Under innledetl 48 timers periode aggregering, cellene når en tilstand lik den som er innenfor fostertap epiblast, der de er i stand til å reagere på signaler fra sekundærmediet 19,21,24. Typisk protokollen beskrevet her gir celler med en puls av sekundært medium som inneholder faktorer (for eksempel Wnt / β-catenin agonister) som gir de signaler som er tilstrekkelig for forlengelse. Tidligere dyrkningsfremgangsmåtene beskrevet av Lancaster et al. (Med humane ESCs 13) og Eiraku et al. (Med mESCs 11) anvendes en kort periode av aggregering i lav adhesjon 96-brønners plater før aggregerte celler ble overført til Matrigel dråper for on- kommer kultur. Selv om tiden mellom aggregering og Matrigel innsetting var forskjellig mellom studiene, i begge tilfeller, ble et stort antall celler som brukes til aggregatdannelse (ca. 3,000-4,500 celler). I motsetning til den protokoll som er beskrevet her 19 benytter langt færre celler (ca. 400 cellerpr aggregat) som er blitt bestemt å være helt avgjørende for prosessen av forlengelse, symmetri brytende og polarisasjonen som er observert 19. I tillegg er disse langstrakte strukturene er i stand til å bli generert i en mye kortere tidsrom uten å bygge i kunstige matriser: sammenligne generasjon av definerte områder av hjernen ved Lancaster et al (> 20-30 dager) 13 og optiske kopper fra Eiraku. et al. (~ 11 dager) 11 med de 5 dager som kreves for generering av polariserte langstrakte strukturer.
En av begrensningene med den dyrkningsmetode som er beskrevet her er imidlertid at de bare kan dyrkes i omtrent 5-6 dager etter utplating inntil deres størrelse gjør dem kompetent under gravitasjon for å synke til bunnen av brønnene og tvinge en adhesjon selv på ikke- belagte plast-ware. Ytterligere eksperimenter ved hjelp av kunstige matriser som for eksempel de som er nevnt tidligere, kan tillate oss å øke periodenobservasjon og eksperimentering, og arbeidet er pågå for å bestemme effektene av begrensende aggregatene på en slik måte. En ytterligere begrensning av denne teknikk er at for å endre mediet uten å fjerne aggregater, må et lite volum av mediet bli liggende i bunnen av brønnen. Konsekvensene for kjemiske genetikk tilnærminger er behov for å vurdere dette fortynning og eventuelle gjenværende effekter fra forrige media: på dagen for tre mikrometer Chi puls, er 2,37 mikrometer løsning faktisk levert, og påfølgende mellom endringer resultere i en carry-over av 0,499 mikrometer (72-96 timer) og 0,105 mikrometer (96-120 t) mellom tidspunktene. Nåværende arbeid har ikke korrigert for fortynning og det antas at daglige mellom endringene vil minimalisere gjenværende effekter.
Det finnes en rekke kritiske trinn i protokollen for å sikre både intra- og inter-eksperimentelle reproduserbarhet. For det første må utgangskultur mESCs være godt vedlikeholdt og ikke over confluent, og medium skal alltid være god kvalitet ie., friskt og godt blandet (figur 5A, B). Dårlige kulturbetingelser påvirke aggregering (figur 5Bi). Nøyaktig telling av celler for å oppnå et ~ 400 celler / 40 ul cellesuspensjon er viktig, da større aggregater ikke klarer å selv-organisere og er mer sannsynlig å danne doble aggregat innen hver brønn (figur 5Bii) mens mindre aggregater ikke er i stand til å nå den riktige tetthet hvor de er i stand til å svare på stimulus (figur 5Biii). Et viktig optimaliseringstrinnet var inkluderingen av en andre PBS vaske som fjerner forurensning serum fra cellesuspensjonen (trinn 2.6); Dette forbedret aggregering hyppigheten og påskyndet utviklingen av aggregatene med ca 24 timer. Deretter blir sikrer mellom endringer påføres med tilstrekkelig kraft til å løsne noen aggregater som har potensial til å holde fast på overflaten av brønnen; unnlatelse av å gjøre det resuLTS i aggregatene 'krasj' (figur 5Biv). I tillegg, og som nevnt tidligere (og under), er det viktig å sikre at aggregatene blir opprettholdt i suspensjonskultur, og er forhindret fra å følge en hvilken som helst overflate. Når aggregatene har levd, er mønsteret av genekspresjon og deres forlengelse potensial forstyrret.
Da denne teknikken er relativt enkel, og godt innenfor rammene av personer med gode vev-kulturteknikker, kan de fleste av problemene forbundet med aggregering løses relativt raskt dersom de kritiske trinn blir fulgt; en fullstendig oversikt over feilsøking er tilgjengelig (tabell 1). Når mestret, kan denne teknikken brukes til å studere aksial utvikling, symmetri bryte og celle-beslutning hendelser. Mer spesifikt er disse aggregater har potensial til å generere bassenger av celler som hittil har vært utilgjengelige i kultur, som for eksempel ryggmargen og motor neuroner.
Etisk Merk: Det bør bemerkes med tilbørlig varsomhet at oversettelsen av denne protokollen til menneskelige ES eller iPS cellekultur kunne bringe eksperimentator nær det juridiske grunnlaget for fjorten dagers frist på menneskelig embryo forskning, nemlig generasjon av en primitiv strek, som beskrevet i Human Gjødsling og Embryology Act 2008 (UK) 42. Siden loven dekker alle levende menneskelige embryoer uavhengig av deres måte av skapelsen, ville kultur av menneskelige gastruloids utover primitive-streak som stadium være utenfor rammen av konsesjonspliktig forskning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er finansiert av en ERC Advanced Investigator Award til AMA (DAT, TB) med et bidrag på et prosjekt Grant fra Wellcome Trust til AMA, en EPSRC studieplass til PB-J og Erasmus, Stichting dr. Hendrik Muller Vaderlandsch Fonds og Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage til SCvdB. Vi ønsker å takke J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, og T. Rodriguez, for diskusjoner og konstruktiv kritikk, Joaquin de Navascués for montering medium protokollen og både AK Hadjantonakis og C. Budjan for å dele sine laboratorie protokoller knyttet til farging av hele montering embryoer. En tidligere versjon av denne artikkelen ble tidligere gjort tilgjengelig på bioRxiv Førtrykk Server 29.
2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
25cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
Centrifuge tubes (15 or 50ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
CHIR 99021 (Chi) | CSCR | n/a | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO |
Dissection Well (30mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
ESLIF | 500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 µL LIF (1000 units). | ||
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | n/a | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. |
n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |