En optimerad metod för att isolera och utöka Invariant Natural Killer T-celler från musmjälte
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
Förmågan att snabbt utsöndra cytokiner vid stimulering är en funktionell egenskap hos den invarianta naturliga mördar-T (inkt) cellinje. inkt celler därför karakteriseras som en medfödd T-cellpopulation med förmåga att aktivera och styra adaptiv immunsvar. Utvecklingen av förbättrade metoder för odling och expansion av murina inkt celler underlättar studiet av inkt cellbiologi i di vitro och in vivo modellsystem. Här beskriver vi en optimerad procedur för isolering och expansion av murina mjält inkt celler.
Mjältar från C57BL / 6-möss avlägsnas, dissekeras och ansträngt och den resulterande cellulära suspensionen skiktas över densitetsgradient media. Efter centrifugering, är mjälten mononukleära celler (MNC) samlas och CD5-positiva (CD5 +) lymfocyter anrikas för att använda magnetiska pärlor. inkt celler inom CD5 + -fraktionen därefter färgas med ^5; GalCer belastad CD1d tetrameren och renades genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). FACS-sorterade inkt cellerna odlas därefter initialt odlas in vitro med användning av en kombination av rekombinanta murina cytokiner och plattbundet T-cellreceptor (TCR) stimuli innan de expanderas i närvaro av murint rekombinant IL-7. Med användning av denna teknik, ungefär 10 8 inkt celler kan genereras inom 18-20 dagars odling, varefter de kan användas för funktionella analyser in vitro, eller för in vivo-överförings experiment i möss.
Introduction
Murin invariant naturlig mördar-T (inkt) celler är en distinkt population av medfödda T-lymfocyter som valts i tymus genom CD1d-uttryckande kortikala tymocyter 1,2. inkt celler uttrycker en T-cellreceptor (TCR) som består av en invariant Vα14-Jα18 TCR-kedjan paras med antingen Vp8, Vβ7 eller Vβ2 TCR 3, som är kapabel att känna igen endogent liksom främmande lipid antigener i samband med CD1d. Exempelvis murina inkt celler känner igen och aktiveras av ett endogent lipid antigen som kallas isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, såväl som α-galaktosylceramid (αGalCer) 5,6, en glykolipid som isolerats från marina svampar. TCR-beroende aktivering av inkt celler främjar priming av adaptiva immunsvar, och som ett resultat har inkt celler visat sig vara funktionellt involverade i förbättring eller utveckling av en rad sjukdomar, inklusive reumatiska sjukdomar 7 och cancer <sup> 8. För närvarande, syntetiska inkt cellligander utgör lovande nya vaccinadjuvans som kan vara i stånd att reglera ett antal immunopatologiska förhållanden.
Det har tidigare visats att inkt celler kan genereras in vitro efter isolering från musvävnad emellertid; många av dessa studier utnyttjar användningen av primära antigenpresenterande celler (APC) och / eller cellinjer 9, Vα14 TCR transgen (Tg) möss 10 eller tymom för alstringen av inkt cellhärledda hybridom 11,12. Dessutom ett stort antal möss, stora volymer av reagens såsom αGalCer-laddade CD1d dimerer och långa odlingstider göra några publicerade protokoll mindre etiskt och ekonomiskt tilltalande 9,13.
I denna rapport beskriver vi en anpassad metod för isolering och in vitro expansion av inkt celler från musmjälte. Närmare bestämt beskriver protokollet en metodför att berika inkt celler från musmjälte vilket minskar möss, reagenser och den tid som krävs för FACS cellsortering, och föreslår en optimerad metod för att expandera sorterade mjälte inkt celler in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i det nuvarande protokollet innefattar isolering och efterföljande berikning av CD5 + lymfocyter (Avsnitt 1 & 2), FACS sortering (3 §) och den initiala plätering av inkt celler (avsnitt 4). Av de åtgärder som utförs i avsnitt 1, kom ihåg att noggrant lager mjälten cellulära suspensionen över densitetsgradienten medium så att en distinkt cellulär inter genereras efter centrifugering. Den efterföljande berikning för CD5 + lymfocyter genom magnetisk cellseparation (avsn…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
Riferimenti
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. . BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in ‘real time’. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
