Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.
Ulike innfallsvinkler har blitt brukt til å registrere og evaluere gastrointestinal motilitet inkludert: opptak endringer i muskelspenninger, intraluminal press, og membranpotensialet. Alle disse fremgangsmåter er avhengig av måling av aktiviteten ved én eller flere steder langs tarmen samtidig som deretter tolket for å gi en følelse av totale motilitet mønstre. Nylig har utviklingen av videoopptak og spatiotemporal kartlegging (STmap) teknikker gjort det mulig å observere og analysere komplekse mønstre i ex vivo hele segmenter av tykktarm og tarm. Når registrert og digitalisert, kan video plater konverteres til STmaps hvor luminal diameter er konvertert til gråtoner eller farge [kalt diameter maps (Dmaps)]. STmaps kan gi data om motilitet retning (dvs. stasjonær, peristaltiske, antiperistaltic), hastighet, varighet, hyppighet og styrke av kontraktile motilitet mønstre. Fordelene med denne tilnærmingen er: analyseverktøs av interaksjon eller samtidig utvikling av forskjellige motilitet mønster i forskjellige deler av samme segment, visualisering av motilitet mønsteret endrer seg over tid, og analyse av hvordan aktiviteten i en region påvirkninger aktivitet i en annen region. Videoopptak kan spilles med forskjellige tidsskalaer og analyseparametere slik at separate STmaps og motilitet mønstre kan analyseres nærmere. Denne protokollen spesielt detaljer effektene av intraluminale væske distensjon og intraluminale stimuli som påvirker motilitet generasjon. Bruken av luminal-reseptor-agonister og antagonister gir mekanistisk informasjon om hvordan bestemte mønstre er igangsatt, og hvor en mønster kan omdannes til et annet mønster. Teknikken er begrenset av evnen til å bare måle motilitet som fører til endringer i luminal diameter, uten å gi data om intraluminale trykkendringer eller muskelspenninger, og ved generering av gjenstander basert på eksperimentelle oppsett; selv, analyseverktøs metoder kan gjøre rede for disse problemene. Sammenlignet med tidligere teknikker videoopptak og STmap tilnærmingen gir en mer helhetlig forståelse av gastrointestinal motilitet.
Ulike metoder for registrering og analyse av intestinal motilitet har blitt utviklet i løpet av de siste 150 år 1. Disse har variert fra den første in vivo-observasjoner og beskrivelser av William Beaumont og Walter Cannon til de nyere metoder for måling og tolkning av multisite opptak av muskelspenninger, intraluminal trykk, og / eller membranpotensial (dvs. synaptiske potensialer) 2 – 6. Disse sistnevnte tilnærminger gir et øyeblikksbilde av samlede motilitet mønstre, men er begrenset av antall steder med opptak og gyldigheten av interpolering av data til områder i mellom opptakssider.
Den siste utviklingen av videoopptak og spatiotemporal kartlegging (STmap) teknikker har gjort det mulig å observere og analysere komplekse motilitet mønstre i ex vivo hele segmenter av tykktarm og tarm. Innledende tilnærminger, først beskrevet for INTEStinal segmenter i slutten av 1990-tallet 7,8, var avhengig av etterforsker-utviklet programvare for å analysere video-opptak; flere grupper har nå opprettet eller endret programvare for dette formålet 2,8 – 12. Mens mange grupper har generert sine egne programvarepakker eller plugins, de alle analysere diameter på en vev segment og konvertere disse forskjellige diametre til gråtoner representasjon. En kommersielt tilgjengelig opptak og analysesystem kalt gastrointestinal motilitet Monitoring System (Gimm) gir en totalentreprise tilnærming som gir mulighet for analyse av både propulsiv motilitet via fekal pellet hastighet besluttsomhet i marsvin distal kolon 13 samt analyse av propulsive og miksing motilitet mønstre med et fluid stimulus i intakte intestinale segmenter 4,5,14 – 19. Denne sistnevnte løsning er avhengig av genereringen og analyse av STmaps og er beskrevet i denne artikkelen. Målet med denne metoden er å øke tHan evne til kvalitativt og kvantitativt analysere ulike motilitet mønstre til stede i tarmen. Mens andre grupper har brukt STmap for motilitet analyse gjennom sin egen programvare, er dette den første beskrivelsen av hvordan du bruker Gimm å analysere motilitet mønstre ved generering av STmaps. I denne artikkelen, gi detaljerte steg-for-steg instruksjoner om vi: utarbeidelse av gut vev for videoopptak, riktig innstilling av videoopptak parametere for å maksimere muligheten til å oppdage endringer i vev diameter, etablering av STmaps, samt tolkning og analyse av STmaps bruker Gimm system og ImageJ programvare.
Metoden som beskrives her er spesifikke for analyse av luminal perfusjon av væsker eller halvfaste stoffer inneholdende forbindelser som påvirker intestinal motilitet mønstre. En fremgangsmåte for analyse av fecal pellet fremdrift er beskrevet i en artikkel av Life og kolleger 13. Den generelle metode som er beskrevet her kan blianvendes på andre rørformede glatt muskulære organer slik som: tynntarmen, blodkar, uretra, urinledere, etc. Selv om denne metode i seg selv ikke gi informasjon om endringer i trykk eller muskelspenninger, kan det bli kombinert med bruk av trykk transdusere, krafttransdusere eller elektrofysiologiske målinger for å gi et mer fullstendig bilde av motilitet mønstre som enkelte andre grupper har vist 2,15,20,21.
Tarmmotiliteten har blitt vist og beskrevet fra en rekke perspektiver basert på natur parametrene blir registrert. Videoopptak og spatiotemporal kartlegging har vist seg et verdifullt verktøy som gjør at analysen av generell bevegelse og / eller fremdrift over lange segmenter av gut samt analyse av aktivitet på bestemte punkter langs segmentet. Tilnærmingen tatt til video-opptak og spatiotemporal kartlegging kan være todelt og er reflektert i regionen undersøkt og arten av de luminale innholdet. I intestinale segmenter hvor luminale innhold er mer flytende og i proksimal colon hvor innholdet er mer semi-faststoff er aktiviteten indusert ved intraluminal innføring av fluidum ved bolus eller infusjon. Tid og rom kartene laget av disse video plater er utformet for å representere bevegelsen av hele segmentet som beskrevet ovenfor. I motsetning til dette, i midten til distale colon hvor innholdet er mer solid, er aktiviteten initieres ved innføring av en fekal pellet (epoksybelagt naturlig eller kunstig pellet pellet), og tid og rom kart er utformet for å reflektere bevegelsen av pellets gjennom tarmen som illustrert i JOVE artikkel av Hoffman et al., 13. Dermed oppsettet av forsøket og analyse er avgjørende, og avhengig av type stimulus og regionen blir studert. Derfor er de kritiske trinn for generering og analysering av tid og rom kart av fluid-indusert intestinal motilitet er: 1) riktig fjerning av mesenteriet fra dissekerte vev; 2) riktig bilde kalibrering før innspillingen; 3) riktig fjerning av gjenstander under STmap generasjon og analyse; 4) riktig oppsett av analysesystem; og 5) få den fingerferdighet å kateterisere og sy segmentene uten å skade dem.
Mens bruken av STmaps av luminale diameter har forbedret evne til å visualisere og analysere komp motilitet mønster over et område av tarmen, er den teknikk som best når kombinert medfunksjonelle målinger av trykk eller muskelkontraksjon 2,15,20. For eksempel, mens enkelte muskelsammentrekninger kan endre luminal diameter litt og være synlig på noen STmaps (dvs. myogeniske krusninger) kan de faktisk ikke forårsake noen fremdrift eller blanding av tarminnholdet 25. Dette kan ikke uten kjent kopling av denne teknikken for andre funksjonelle målinger. Også arten av mange vevspreparater i denne type system (det vil si et lukket system luminal eller konstant luminal perfusjon av et pumpesystem) fører til gjenstander innenfor STmaps. Dermed må brukeren være klar over hvordan deres spesifikke organ forberedelse og eksperiment kan føre til artefakter i data og måter å unngå eller utelukke disse gjenstandene i dataanalyse (f.eks mesenterium-indusert vertikale linjer eller mørk pikselering på grunn av vevets manglende evne til fordrive fluidet fra systemet i en lukket luminal forberedelse). Det er flere metoder for luminal perfusjon av en intakt intestinal segment foruten et lukket system. En metode er å i stedet bruke et åpent system som opprettholder en konstant intraluminal / mottrykk ved hjelp av en hevet rør og / eller enveisventil på anal slutten av fremstillingen 8-10,30. Dette gjør væsken å flytte ut av preparatet under propulsive sammentrekninger.
Ettersom systemet er satt opp hovedsakelig for å oppdage endringer i luminal diameter, disse sammentrekninger eller motilitet mønstre som ikke i stor grad påvirker luminal diameter er ofte vanskelig å visualisere ved denne protokollen. Ettersom endringer i pikselskyggelegging i STmap er basert på endringer i luminal diameter, vil motilitet mønstre som ikke medfører store endringer i diameter ikke bli visualisert godt i denne metoden hvis sterke sammentrekninger er også til stede i det samme opptaket. Som beskrevet for visualisering og analyse av ringtypen kontraksjon (figur 3), innstilling av analyselinjer i video nærmere to vevet veggen kan overflødiggjøre dette problemet. Denne fremgangsmåten reduserer den maksimale diameter som vises i STmap, slik sammentrekninger som bare minimalt endrer vev diameter kan visualiseres. En annen mulighet for å løse dette problemet er å endre varigheten av videosegmentet analysert, for å utelukke sammentrekninger som i stor grad påvirker luminal diameter, slik at mindre sammentrekninger er lettere visualisert. Dette fører til det potensielle problemet med bevegeligheten som minimal endrer luminal diameter ser ligner en egen STmap hvor sammentrekninger i stor grad endret luminal diameter. Dette er fordi bestemmelsen av hvite piksler på kartet er basert på den minste diameteren i et gitt video. Dersom det er ikke mye variasjon i diameter innenfor videoen (liten eller ingen kontraksjon av den sirkulære muskel) meget små sammentrekninger som ikke endrer diameteren av preparatet kan i stor grad ligne peristaltiske sammentrekninger fra en annen video. Derfor er det viktig å vurdere figurenlegende i øvre høyre hjørne av kartet. Dersom forskjellen mellom maksimum og minimum diameter er liten er det viktig å sammenligne STmap til video det ble generert fra å avgjøre gyldigheten av pixel skyggen endring som representert i STmap. Således er undersøkelse av målestokken i forbindelse med selve opptaket kritisk for korrekt tolkning av kartet.
Videoopptak og spatiotemporal kartlegging av tarm og colonic segmenter har blitt brukt til en rekke arter inkludert sebrafisk 26, mus 25,27 – 30, rotte 7,9,30 – 33, marsvin 5,6,8,13 – 19, 24,30,32,34,35, brushtail possum 12,36, kanin 2,30,37,38, kylling 39, gris 40,41 og menneskelig 42. De mest studerte artene er marsvin. Dette er ikke overraskende fordi marsvin enteriske nervesystemet hsom er mest fullstendig karakterisert, og historisk sett har vært den mest studerte dyr in vitro med hensyn til driv motilitet av tarmen 43. Har vært mest anvendt Spatiotemporal tilordning til rørformede segmenter av tarmen fra små dyr; Men studier på kanin og gris ved hjelp av modifiserte systemer demonstrere anvendelsen av denne metode til større dyr. I tilfellet med kanin, er problemstillingen identisk med mindre dyr, bortsett fra at større segmenter og organbad ble anvendt 30. Den tilnærmingen som brukes i grisen var å bruke en exteriorized løkke av tarmen fra en bedøvet gris i stedet for nedsenking av en dissekert vev segment til et organ bad. Også STmaps ble dannet ved krysskorrelasjon i stedet for gjennomlysnings metoden som brukes i de fleste studier 40. Den isolerte, vascularly perfusert sløyfe forberedelse til video-opptak og spatiotemporal kartlegging har også blitt brukt til mindre arter som rotte <sup> 33. En fersk studie av Kuizenga et al. er den første bruken av STmaps av video innspilt motilitet mønstre i ex vivo segmenter av tarmen 42; selv, STmapping tilnærminger har blitt brukt til analyse av manometriske (trykk) innspillinger hos mennesker in vivo 3,44. De registrerte motilitet mønstre i humant vev er lik de som allerede er registrert i dyremodeller ved bruk av lignende teknikker og validere den utvidelse av denne tilnærmingen til menneskelig vev. Det er bemerkelsesverdig at denne studien kombinert STmaps avledet fra videoopptak med måling av muskelsammentrekning registrert av krafttransdusere. Måling av trykk ved intraluminal en fiberoptisk manometrisk kateter settes inn i ex vivo-segmentet ble også omdannet til en STmap, som viser allsidigheten av STmap å visualisere mer enn endringer i luminale diameter. Dette kombinert tilnærming samkjøre muskelspenninger, tillater intraluminal press og vegg bevegelsefor en mer dyptgående funksjonell analyse av STmaps generert fra video-opptak.
Studier av STmaps generert fra vegg bevegelser og endringer i luminal diameter (også kalt Dmaps) har tillatt detaljerte beskrivelser av motilitet mønstre som propulsive peristaltiske bølger og lokaliserte segment sammentrekninger. Mens disse mønstrene ble identifisert ved tidligere eksperimentelle metoder, gjør at dagens tilnærming en mer raffinert definisjon av lokaliserte kontraktile bevegelser som krusninger og nye anti-peristaltiske sammentrekninger 9,24,25,30,31,42. Byggingen av STmaps og analyse av endringer i motilitet mønsteret har blitt brukt til viktige spørsmål i gastrointestinal motilitet av tarmen og kolon. Disse inkluderer: differensiering av nevrogene og myogeniske sammentrekninger og definere rollen interstitielle celler av Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 – 31,33,37 – 40,42, forstå det komplekseinteraksjoner mellom de sirkulære og langsgående muskellagene 2,7,8,11,12,32,39,40, som undersøker effekten av intraluminale næringsstoffer 10,18,19, mikrobielle stammer 34 og viskositet 12,36 på ulike motilitet mønstre, og forstå rollen av ulike endogene neurohormonal agenter og eksogene farmakologiske midler 2,4 – 7,9,10,13 – 17,28,35,40 i produksjon og modifikasjon av motilitet. Fremtiden for denne teknikken innebærer kopling den med andre målinger, inkludert trykk, elektrofysiologi og spenning / kontraktilitet. Nyere studier har ofte inkorporert en eller flere av disse målingene sammen med video-opptak og spatiotemporal kartlegging for å gi ytterligere detaljer korrelative 2,42. Dessuten kan systemet benyttes til å måle motilitet i andre rørformede og ikke-rørformede organer. For eksempel har det blitt gjort forsøk på å måle gastrisk motilitet ved hjelpet slikt system, men teknikken og programvare må raffinement for bedre å kvantifisere motilitet i en slik ikke-rørformet organ 45. Det er ingen tvil om at bruk av tid og rom kartlegging teknikker alene og i kombinasjon med mer tradisjonelle analysemetoder vil føre til en mer dyptgående og helhetlig forståelse av gastrointestinal motilitet i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
DMK ble støttet av en IRACDA stipend fra NIGMS (K12GM093857) til Virginia Commonwealth University. Dette arbeidet ble støttet av NIDDKD tilskuddet DK34153 til John R. Grider.
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | For Krebs buffer. |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher | BP366 | For Krebs buffer. |
Potassium Phosphate (KH2PO4) | Fisher | P285 | For Krebs buffer. |
Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | For Krebs buffer. |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C7902 | For Krebs buffer. |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328 | For Krebs buffer. |
Glucose | Sigma | G7021 | For Krebs buffer. |
Carboxygen (95%O2/5%CO2) | |||
Dissecting pins | |||
Dissecting trays/dishes | |||
Dunkin Hartley Guinea Pigs | Charles River | Strain 051 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | Freely available online. | |
GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM) | Catamount Inc., St. Albans, Vermont | Includes parts listed below. | |
Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
Bath Cameras | Included with GIMM. | ||
Bath TransIllumination Backlights | Included with GIMM. | ||
Organ Baths | Included with GIMM. | ||
Backlight Intensity Controls | Included with GIMM. | ||
GIMM Processor ImageJ Plugin | Included with GIMM. | ||
Polyethylene Tubing | Included with GIMM. | ||
Tubing Connectors | Included with GIMM. | ||
Masterflex tubing for Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
Heating Bath/Water Circulator | Included with GIMM. |