Epitelceller Återplantering och framställning av gnagare Extracellular Matrix Byggnadsställningar för njurvävnad utveckling
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
Detta protokoll detaljer alstringen av acellulära, ännu biofunktionella, njur extracellulär matris (ECM) byggnadsställningar som är användbara som småskaliga modellsubstrat för organ skala vävnadsutveckling. Sprague Dawley råttnjurar kanyleras genom insättning av en kateter in i njurartären och perfuserades med en serie detergenter lågkoncentrerade (Triton X-100 och natriumdodecylsulfat (SDS)) över 26 timmar för att härleda intakta, hela njur ställningar med intakt perfusable kärl, glomeruli, och njurtubuli. Efter decellularisering, är den renala ställningen placeras inuti ett skräddarsytt perfusionsbioreaktor kärlet och kateter njurartären är ansluten till en perfusionskrets som består av: en peristaltisk pump; slang; och valfria sönder för pH, löst syre, och tryck. Efter sterilisering ställningen med perättiksyra och etanol, och balansera pH (7,4), är njuren ställningen förberedd för sådd via perfusion odlingsmedium inom en large-kapacitet inkubator som hölls vid 37 ° C och 5% CO2. Fyrtio miljoner renal kortikal rörformiga epiteliala (RCTE) celler injiceras genom njurartären, och snabbt perfunderades genom ställningen under högt flöde (25 ml / min) och tryck (~ 230 mm Hg) under 15 min innan minska flödet till en fysiologisk hastighet (4 ml / min). RCTE celler befolka främst rörformiga ECM nisch inom njurbarken, förökar sig och bildar tubulära epitelceller strukturer under sju dagar perfusionsodling. En 44 iM resazurin lösning i odlingsmedium perfuseras genom njuren under 1 timme under medel utbyte för att ge en fluorometrisk, redox-baserade metabolisk bedömning av cellviabilitet och spridning under tubulogenesis. Njuren perfusionsbioreaktor tillåter icke-invasiv provtagning av medium för biokemisk bedömning, och flera inloppsportar tillåter alternativa bakåtsträvande sådd genom njurvenen eller urinledaren. Dessa protokoll kan användas för att recellularize njur ställningar med enolika celltyper, inklusive vascular endothelial, tubulär epitel, och stromala fibroblaster, för snabb utvärdering inom detta system.
Introduction
Eftersom antalet patienter som lider av slutstadiet njursvikt fortsätter att öka, det är en allvarlig och växande brist i antalet givar njurar tillgängliga för transplantation. Oförmågan att möta efterfrågan av ett ständigt ökande antal kandidater vänta-listade för njurtransplantation har lett till forskning inom njurorganteknik med det yttersta målet att utveckla kundanpassade, implanterbara njurtransplantat på begäran 1,2. Att bygga fungerande njurvävnad från en patients egna celler skulle eliminera behovet av livslångt immunsuppression, minska den tid patienter tillbringar på dialys väntar på en njurtransplantation, och utöka livräddande transplantation till fler patienter med kronisk njursjukdom.
Det första steget mot bioteknik en njurvävnad med hjälp av patientgenererade celler är att utveckla en byggnadsställning som fungerar som en stödjande substrat för njurparenkym (t.ex. tubulär epitheLial), stroma fibroblast och kärlcelltillväxt. Biomaterial ställningar som härrör från naturliga organextracellulära matriser (ECM) har flera egenskaper som gör dem önskvärda för användning i vävnadsteknik, inklusive deras naturliga biologiska sammansättning; lämplig makro- och mikro att förse fysiologiska funktioner; och cellulära biokompatibilitet, främja celladhesion, migrering och konstruktiv vävnad remodeling 3. En lovande metod för framställning av ställningar för njurvävnadsregenerering är genom decellularisering av allogena eller xenogena njurar som bevarar en stor del av den komplexa naturliga proteinkompositionen av njuren ECM 4, behålla den inneboende arkitektoniska intrikat av organet, och övervinna svårigheten i samband med bottom upp konstruktion av tjocka cellularized vävnader genom att tillhandahålla en vaskulär tillförsel till utvecklings celler efter byggnadsställning recellularization 5.
Perfusion decellularisering är en process ivilka detergenter, enzymer eller andra cellstörande lösningar likformigt avges genom det vaskulära nätverket av organet 6. Denna strategi har etablerats som en effektiv process för att härleda acellulära organbaserade ECM ställningar som tredimensionella (3D), biologiska mallar för hela organteknik 6-8, vilket framgår av utvecklingen av acellulära njur mallar från kasserade mänskliga njurar 9 och xenogena njurar som erhållits från stora djur (t.ex. gris 10, get 11) och gnagare källor 12. I synnerhet användningen av små djurmodeller såsom gnagare kräver färre celler och odlingsmedia, vilket är särskilt användbart för organ recellularization studier där cellantalet är vanligen begränsade, såsom är fallet med stamcellshärledda vävnader. Målet med den beskrivna decellularisering protokollet är att producera ett acellulärt njur ECM som kan användas som en 3D-byggnadsställningssystem för regenerering av njure structures, inklusive nephron tubuli som nyinsatta i föreliggande exempel med humant renalt kortikala tubulära epitelceller (RCTE) -celler. Vi beskrev tidigare vår noggrann utvärdering av en optimal, tvättmedel baserade råttnjure decellularisering protokoll 7, vilket är snabbare (cirka en dag) än andra metoder som tidigare rapporterats (Ross et al .- 5 dagar 12, Song et al .- 4,5 dagar 13), och exponerar organet till en betydligt lägre koncentration (0,1%) av den denaturerings natriumdodecylsulfat (SDS) under decellularisering än tidigare rapporter 12-15.
Ett begränsat antal studier har beskrivit användningen av gnagare njurar för decellularisering och efterföljande användning som en 3D-byggnadsställning för cellulär återinsättning (ses över någon annanstans 1) 12-16. I detta protokoll ger vi en detaljerad beskrivning av vår tidigare fastställda, optimala decellularisering strategi för framställning av acellulära njur byggnadsställningarfrån Sprague Dawley råttnjurar 7. Använda skräddarsydda perfusion bioreaktorer kan dubbla sådd och underhåll perfusionsodling 17, vi recellularize de acellulära njur ställningar med mänskliga RCTE celler, som konsekvent återbefolka den rörformiga komponenten i dessa decellulariserade matriser, föröka sig och överleva i perfusion kultur för över en vecka. Vi visar ytterligare vår användning av resazurin perfusion analys – en billig, icke-cytotoxiska och icke-invasiv metabolic bedömning som tidigare använts för cytotoxicitetsstudier 17 – att ge en indikation på cellviabilitet och spridning inom de recellularized njurar över tiden 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrivna decellularisering protokollet konsekvent ger en helt acellulärt njure ECM som fungerar som en 3D-mall för odling av humana njur kortikala tubulära epitelceller (både proximala och distala tubuli härrörande), förutom vaskulära endotelceller 7,17. Den kanyl njurkärl fungerar som det viktigaste inslaget för jämn tillförsel av reagenser och celler i hela ställningen inom en bioreaktor set-up, vilket gör det möjligt för perfusion decellularisering, cellsådd, långsiktig perfusion kul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
Riferimenti
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
- Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
- Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
- Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
- Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).
