Collecte de sang répétées pour des tests sanguins dans le poisson zèbre adulte
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
Collecte de sang répétées est une des techniques les plus courantes effectuées sur des animaux de laboratoire. Cependant, un protocole non létal pour le prélèvement de sang à partir du poisson zèbre n'a pas été établie. Les méthodes précédentes pour la collecte de sang de poisson zèbre sont mortelles, comme incision latérale, la décapitation et la queue ablation. Ainsi, nous avons développé une nouvelle méthode "répétée" de collecte de sang, et présente ici un protocole détaillé décrivant cette procédure. Cette méthode est peu invasive et se traduit par un taux de mortalité très faible (2,3%) pour le poisson-zèbre, permettant ainsi répété le prélèvement de sang à partir du même individu. Le volume maximal de prélèvement de sang est fonction de poids du corps du poisson. Le volume pour un échantillonnage répété de sang à des intervalles doit être ≤0.4% du poids du corps de chaque semaine ou ≤1% toutes les 2 semaines, qui ont été évalués par des mesures de l'hémoglobine dans le sang. En outre, l'hémoglobine, la glycémie à jeun, le plasma triacylglycérols (TG) et c totaleniveaux de holesterol chez le poisson zèbre adultes mâles et femelles ont été mesurés. Nous avons également appliqué cette méthode pour étudier la dysrégulation du métabolisme du glucose dans l'obésité induite par l'alimentation. Cette méthode de collecte de sang permet de nombreuses applications, y compris le glucose et le métabolisme des lipides et des études hématologiques, ce qui augmentera l'utilisation du poisson zèbre comme organisme modèle de maladie humaine.
Introduction
Zebrafish gagnent en popularité comme un modèle précieux de maladies humaines parce que leurs organes et la génétique sont similaires à ceux des humains 1,2. Dans le domaine de la biologie du développement, de nombreuses études ont démontré que le poisson zèbre et de montrer humaine marqués similitude dans l'hématopoïèse 3, hémostase 4,5 et 6 myélopoïèse. Poisson zèbre adultes sont également utilisés pour l'étude immunologique 7, 8 et les maladies neurodégénératives liées à l'obésité 9 car cet organisme modèle actions voies communes avec ceux perturbé dans les maladies humaines. Pour l'obésité et les maladies liées à l'obésité (diabète, la stéatose hépatique non alcoolique et la stéatohépatite et athérosclérose), le poisson-zèbre niveaux de lipides et de glucose dans le sang ont été examinées à fond dans plusieurs modèles transgéniques et l'obésité induite par l'alimentation 10-13.
Répétée prélèvement de sang d'animaux individuels permettra de réduire l'utilisation des animaux et diminuerRease différences interindividuelles. Cependant, la collecte de l'échantillon répété est techniquement difficile chez les petits animaux tels que le poisson-zèbre à cause de leur volume de sang relativement faible et le manque de récipients facilement accessibles. Plusieurs méthodes de collecte de sang ponctuelle de poisson zèbre ont été développés, bien que ces méthodes ont leurs propres inconvénients, y compris la létalité, lésions tissulaires associées et le volume sanguin limitée. Par exemple, 1 à 5 ul de sang peut être récolté à partir d'une incision latérale d'approximativement 0,3 cm de longueur dans la zone de l'aorte dorsale 5. Décapitation avec des ciseaux en coupant à travers la ceinture scapulaire peut recueillir le sang de 5-10 ul 10. Une autre méthode de prélèvement de sang est commode queue ablation 14. Ponction cardiaque est une méthode alternative potentielle pour la collecte de sang répétées du même poisson, mais la très petite quantité obtenue (environ 50 nl) avec cette procédure limite le nombre d'analyses qui peuvent être performed 11. En conséquence, un nouveau protocole est nécessaire pour permettre un échantillonnage répété de sang non-létale, ce qui serait une avancée critique nécessaire pour cet organisme d'être un organisme modèle standard pour les maladies humaines. Cette technique permettrait d'essai réponse pharmacologique, la découverte de marqueurs biologiques moléculaires pour le diagnostic, la détermination du pronostic et la surveillance de diverses maladies telles que les maladies métaboliques, des maladies dégénératives et plusieurs types de tumeurs malignes.
Nous avons donc développé une méthode minimalement invasive pour obtenir le sang de poisson zèbre en série 15. Ici, nous démontrons la procédure visuellement et fournissons un protocole détaillé pour cette technique. En utilisant cette méthode, la valeur normale sur la base de différents paramètres, dont l'hémoglobine, la glycémie à jeun, et de lipides dans le sang du poisson zèbre adultes en bonne santé ont été évalués. En outre, nous avons également évalué si cette méthode est adaptée pour les études qui nécessitent des échantillons en série par murveillance les changements temporels dans les niveaux de glucose sanguin au cours des expériences suralimentation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici un protocole détaillé pour l'obtention de série sang de poisson zèbre adulte. Cette méthode est simple à réaliser et nous l'utilisons dans le laboratoire sur une base quotidienne. Cette méthode de collecte de sang est basée sur insérant une aiguille capillaire en verre dans l'aorte dorsale du poisson zèbre. Au cours de cette procédure, il est essentiel de veiller à ne pas pratiquer l'ablation de la colonne vertébrale, car il est le critère pour la recherche de l'ao…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
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