كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
جمع الدم المتكررة هي واحدة من التقنيات الأكثر شيوعا التي أجريت على حيوانات المختبر. ومع ذلك، لم يثبت بروتوكول غير قاتلة لجمع الدم من الزرد. الطرق السابقة لجمع الدم من الزرد هي القاتلة، مثل شق الجانبي، وقطع الرأس والذيل الاجتثاث. وهكذا وضعنا رواية "المتكررة" طريقة جمع الدم، والحاضر هنا بروتوكول مفصلة توضح هذا الإجراء. هذا الأسلوب هو الغازية الحد الأدنى والنتائج في معدل وفيات منخفضة جدا (2.3٪) لالزرد، وبالتالي تمكين المتكررة اخذ عينات من الدم من نفس الفرد. الحد الأقصى لحجم اخذ عينات من الدم يعتمد على وزن جسم السمكة. يجب أن يكون حجم لأخذ عينات الدم المتكرر على فترات ≤0.4٪ من وزن الجسم كل أسبوع أو ≤1٪ كل 2 أسابيع، والتي تم تقييمها من قبل القياسات الهيموغلوبين في الدم. بالإضافة إلى ذلك، الهيموجلوبين، وصوم الجلوكوز في الدم، الدهون الثلاثية البلازما (TG) وإجمالي جتم قياس مستويات holesterol في الزرد الكبار من الذكور والإناث. علينا أيضا أن تطبق هذه الطريقة للتحقيق في ديسريغولاتيون ايض الجلوكوز في النظام الغذائي الناجم عن السمنة. هذه الطريقة سوف جمع الدم تسمح العديد من التطبيقات، بما في ذلك الجلوكوز واستقلاب الشحوم والدراسات الدموية، الأمر الذي سيزيد من استخدام الزرد كنموذج المرض كائن البشري.
Introduction
الزرد تكتسب شعبية متزايدة باعتبارها نموذجا قيما من الأمراض التي تصيب الإنسان بسبب أعضائهم وعلم الوراثة مماثلة لتلك التي من البشر 1،2. في مجال علم الأحياء التطوري، وقد أثبتت العديد من الدراسات أن الزرد وتظهر البشري علامة التشابه في تكون الدم 3، الارقاء 4،5، وتكون النقويات 6. وتستخدم الزرد الكبار أيضا لدراسة المناعية 7، 8 الاعصاب والأمراض المرتبطة بالسمنة 9 لأن هذا النموذج الحي سهم مسارات مشتركة مع تلك تعطلت في الأمراض التي تصيب الإنسان. للسمنة والأمراض المرتبطة بالسمنة (السكري، تشحم الكبد غير الكحولي والتهاب الكبد الدهني وتصلب الشرايين)، وقد تم التحقيق الزرد السكر في الدم ومستويات الدهون تماما في العديد من النماذج المعدلة وراثيا السمنة والنظام الغذائي الناجم عن 10-13.
سوف تتكرر أخذ عينات دم من الحيوانات الفردية تقليل استخدام الحيواني وديسمبرrease الخلافات interindividual. ومع ذلك، وجمع عينة متكررة من الصعب من الناحية الفنية في الحيوانات الصغيرة مثل الزرد بسبب حجمها الصغير نسبيا في الدم وعدم وجود السفن الوصول إليها بسهولة. وقد وضعت عدة طرق لجمع الدم لمرة واحدة من الزرد، على الرغم من أن هذه الطرق لها سلبياتها الخاصة، بما في ذلك الفتك، تلف الأنسجة المرتبطة وحجم الدم محدودة. على سبيل المثال، 1-5 الدم ميكرولتر يمكن حصاده من شق الوحشي من حوالي 0.3 سم في الطول في المنطقة من الشريان الأبهر الظهري 5. قطع الرأس مع مقص من خلال قطع حزام الصدر يمكن جمع 5-10 ميكرولتر الدم 10. مريحة طريقة أخرى أخذ عينات الدم هو ذيل الاجتثاث 14. ثقب في القلب هو طريقة بديلة محتملة واحدة لجمع الدم المتكررة من نفس السمك، ولكن كمية صغيرة جدا الحصول على (ما يقرب من 50 NL) مع هذا الإجراء يحد من عدد من التحليلات التي يمكن أن تكون ادائهاميد 11. وفقا لذلك، هناك حاجة إلى بروتوكول جديد لتمكين المتكررة اخذ عينات من الدم غير المميتة، والتي ستكون تقدما بالغ الأهمية اللازمة لهذا الكائن أن يكون كائن النموذج القياسي لأمراض الإنسان. أن هذه التقنية تسمح لاختبار استجابة الدوائية، اكتشاف المؤشرات الحيوية الجزيئية للتشخيص وتحديد التشخيص، ورصد مختلف الأمراض، مثل أمراض التمثيل الغذائي والأمراض التنكسية وعدة أنواع من الأورام الخبيثة.
لذا طورنا طريقة مينيملي للحصول على الدم من الزرد متسلسل 15. نحن هنا لشرح الإجراء بصريا وتوفير بروتوكول مفصلة لهذه التقنية. باستخدام هذه الطريقة، تم تقييم القيمة العادية على أساس معايير مختلفة، بما في ذلك الهيموغلوبين، وصوم الجلوكوز في الدم، ونسبة الدهون في الدم من الزرد البالغين الأصحاء. بالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا تقييم ما إذا كانت هذه الطريقة مناسبة للدراسات التي تتطلب عينات التسلسلية التي كتبها monitoring التغيرات الزمانية في مستويات السكر في الدم أثناء التجارب فرط.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم هنا بروتوكول مفصلة للحصول على متسلسل الدم من الزرد الكبار. هذه الطريقة واضحة ومباشرة لتنفيذ ونستخدمها في المختبر على أساس يومي. ويستند هذا الأسلوب جمع الدم على إدخال إبرة الشعرية الزجاج في ظهري الشريان الأورطي الزرد ل. خلال هذا الإجراء، فمن الأهمية بمكان أن نكو?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
Riferimenti
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474 (2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -. P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
