Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
Wiederholte Blutentnahme ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken bei Labortieren durchgeführt. Allerdings hat eine nicht-tödliche Protokoll für die Blutentnahme aus Zebrafisch nicht nachgewiesen. Die bisherigen Verfahren zur Blutentnahme aus Zebrafisch sind tödlich, wie laterale Inzision, Enthauptung und Schwanz Ablation. So haben wir eine neuartige "wiederholte" Blutabnahmeverfahren ein detailliertes Protokoll umreißt dieses Verfahren entwickelt, und heute hier. Dieses Verfahren ist minimal-invasiv und führt zu einer sehr geringen Sterblichkeit (2,3%) für Zebrafisch, wodurch wiederholte Entnahme von Blut aus dem gleichen Individuum. Das maximale Volumen der Blutabnahme ist abhängig vom Körpergewicht der Fische. Das Volumen für wiederholte Entnahme von Blut in Abständen sollte ≤0.4% des Körpergewichts pro Woche oder ≤1% alle 2 Wochen, was durch Messungen der Hämoglobin bewertet wurden sein. Zusätzlich Hämoglobin, Nüchternblutzucker, Plasma Triacylglycerol (TG) und c insgesamtholesterol Ebenen bei männlichen und weiblichen erwachsenen Zebrafisch wurden gemessen. Wir wendeten diese Methode auch, um die Fehlregulation des Glukosestoffwechsels in ernährungsbedingte Fettleibigkeit zu untersuchen. Dieses Blutsammelverfahren wird viele Anwendungen, einschließlich Glucose- und Fettstoffwechsels und hämatologischen Studien, die die Verwendung eines Zebrafischs als menschliche Krankheitsmodell Organismus erhöhen können.
Introduction
Zebrafische sind gewinnt zunehmend an Popularität als ein wertvolles Modell der menschlichen Krankheiten, weil ihre Organe und Genetik ähnlich denen des Menschen 1,2 sind. Auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, haben viele Studien gezeigt, dass die Zebrafisch und Menschen zeigen deutliche Ähnlichkeit in der Hämatopoese 3, Blutstillung 4,5 und Myelopoese 6. Erwachsenen Zebrafisch sind ebenfalls für die Untersuchung immunologischer 7, neurodegenerative 8 und Fettleibigkeit bedingte Krankheiten 9, weil dieses Modellorganismus Aktien gemeinsamen Wege mit denen in menschlichen Erkrankungen gestört verwendet. Für Übergewicht und Fettleibigkeit bedingte Krankheiten (Diabetes, Fettleber und nichtalkoholische Steatohepatitis und Atherosklerose), Zebrafisch-Blutzucker und Lipide Ebenen wurden gründlich in mehreren transgenen und ernährungsbedingte Fettleibigkeit Modelle 10-13 untersucht.
Wiederholte Entnahme von Blut aus einzelnen Tiere Tiernutzung und Dezember zu reduzierenRease interindividuelle Unterschiede. Jedoch ist wiederholte Probennahme wegen ihrer relativ kleinen Blutvolumen und der Mangel an leicht zugänglichen Gefäßen technisch schwierig bei kleinen Tieren wie Zebrafisch. Verschiedene Methoden für die einmalige Blutentnahme von Zebrafisch entwickelt, obwohl diese Methoden haben ihre eigenen Nachteile, einschließlich Letalität assoziiert Gewebeschäden und begrenzte Blutvolumen. B. 1-5 & mgr; l Blut von einem seitlichen Einschnitt von etwa 0,3 cm in der Länge in dem Bereich des dorsalen Aorta 5 geerntet werden. Enthauptung mit einer Schere durch Schneiden durch den Schultergürtel kann 5-10 & mgr; l Blut 10 zu sammeln. Eine weitere praktische Blutentnahme Methode ist tail Ablation 14. Herzpunktion ist eine mögliche alternative Verfahren für wiederholte Blutentnahme aus dem gleichen Fisch, aber die sehr geringe Menge erhalten (etwa 50 nl) mit diesem Verfahren begrenzt die Anzahl der Analysen, die Leis sein kannMed. 11 Dementsprechend wird ein neues Protokoll benötigt, um wiederholter nicht-tödliche Blutabnahme, die zu kritischer Voraus erforderlich wäre dafür Organismus auf eine Standard-Modellorganismus für menschliche Krankheiten zu ermöglichen. Diese Technik würde zum Testen pharmakologische Reaktion, Entdeckung von Molekular Biomarker für die Diagnose, die Bestimmung der Prognose und die Überwachung von verschiedenen Krankheiten, wie Stoffwechselerkrankungen, degenerativen Erkrankungen und verschiedenen Arten von bösartigen Erkrankungen ermöglicht.
Deshalb entwickelte eine minimal-invasive Verfahren zur Gewinnung von Blut von Zebrafischen in Reihe 15. Hier werden wir den Vorgang visuell nachweisen und ein detailliertes Protokoll für diese Technik. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden der normale Wert auf der Grundlage verschiedener Parameter, einschließlich Hämoglobin, Nüchternblutzucker und Lipide im Blut von gesunden erwachsenen Zebrafisch ausgewertet. Zusätzlich haben wir auch bewertet, ob diese Methode eignet sich für Studien, die serielle Proben durch m verlangenBERWACHUNG die zeitlichen Veränderungen der Blutzuckerwerte während der Überfütterung Experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellen Ihnen hier eine detaillierte Protokoll zur seriellen Blutentnahme von erwachsenen Zebrafisch. Dieses Verfahren ist einfach durchzuführen und wir sie verwenden im Labor auf einer täglichen Basis. Das Blutsammelverfahren zum Einsetzen einer Glaskapillare Nadel in den Zebrafisch der dorsalen Aorta basiert. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, vorsichtig zu sein, um nicht zu ablatieren die Wirbelsäule, weil sie das Kriterium für die Suche nach der dorsalen Aorta ist. Die Verringerung der Wirbelsäulenv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
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