Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
איסוף דם חוזרים ונשנים הוא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר שבוצעו בחיות מעבדה. עם זאת, פרוטוקול לא קטלני לאיסוף דם מדג הזברה לא הוקם. השיטות הקודמות לאיסוף דם מדג הזברה הן קטלניות, כגון חתך לרוחב, עריפת ראש והזנב אבלציה. כך פיתחנו שיטה חדשה "חזר" איסוף דם, ובהווה כאן פרוטוקול מפורט המתאר הליך זה. שיטה זו היא פולשנית ותוצאות בשיעור תמותה נמוכה מאוד (2.3%) לדג זברה, ובכך לאפשר דגימת דם חוזרת ונשנית של אותו אדם. הנפח המרבי של דגימת דם תלוי במשקל גוף של הדג. נפח דגימת דם חוזר ונשנה במרווחים צריך להיות ≤0.4% ממשקל גוף בכל שבוע או ≤1% כל 2 שבועות, שהוערכו על ידי מדידות של המוגלובין בדם. בנוסף, המוגלובין,, triacylglycerol צום סוכר בדם הפלזמה (TG) וג הכוללרמות holesterol בדג זברה מבוגרת זכר ונקבה נמדדו. אנחנו גם מיושמים בשיטה זו כדי לחקור את חוסר הוויסות של חילוף חומרים של הגלוקוז בהשמנה יתר הנגרם דיאטה. שיטת איסוף דם זה תאפשר יישומים רבים, כולל גלוקוז וחילוף חומרים של שומנים ומחקרים המטולוגיות, אשר יגדילו את השימוש בדג הזברה כאורגניזם מודל מחלה אנושי.
דג הזברה צוברת פופולריות גוברת כמודל ערך של מחלות בבני אדם משום שהאיברים והגנטיקה שלהם דומים לאלה של בני אדם 1,2. בתחום הביולוגיה התפתחותית, מחקרים רבים הראו כי דג הזברה ומופע אנושי מסומנות דמיון בhematopoiesis 3, עצירת הדימום 4,5, וmyelopoiesis 6. דג הזברה מבוגרת משמש גם ללימוד חיסוני 7, 8 ניווניות ומחלות הקשורות להשמנה 9 כי מניות אורגניזם מודל זה מסלולים משותפים עם אלה שיבשו במחלות בבני אדם. להשמנת יתר ומחלות הקשורות להשמנת יתר (סוכרת, הכבד וsteatosis steatohepatitis נטול אלכוהול וטרשת עורק), רמת סוכר בדם ורמות שומני דג הזברה נחקרו ביסודיות במספר דגמי השמנה מהונדס ומושרה דיאטה 10-13.
דגימת דם חוזרת ונשנית של בעלי חיים פרט להפחית את השימוש בבעלי חי ודצמrease הבדלי interindividual. עם זאת, אוסף מדגם חוזר ונשנה הוא קשה מבחינה טכנית בבעלי חיים קטנים כמו דג הזברה בגללם קטן יחסית נפח הדם וחוסר כלי נגישים בקלות. כמה שיטות לחד פעמי איסוף דם מדג הזברה פותחו, למרות שיש לי שיטות אלה חסרונות שלהם, כולל קטלני, נזק לרקמות קשורות ומוגבל נפח דם. לדוגמא, 1-5 דם μl ניתן לקצור מחתך רוחב של כ -0.3 סנטימטר באורך באזור של אב העורקים גב 5. עריפת ראש במספריים על ידי חיתוך דרך חגורת החזה יכול לאסוף 5-10 μl דם 10. שיטת דגימת דם נוחה נוספת היא אבלציה זנב 14. לנקב לב הוא שיטה חלופית פוטנציאלית אחד לאיסוף דם חוזר ונשנה של אותו דג, אבל הכמות קטנה מאוד שהושגה (כ 50 NL) עם הליך זה מגביל את מספר הניתוחים שיכולים להיות performed 11. בהתאם לכך, יש צורך בפרוטוקול חדש שיאפשר דגימה החוזרת ונשנית לא קטלנית דם, אשר תהיה מראש קריטי הכרחיות לאורגניזם זה להיות אורגניזם מודל סטנדרטי למחלות בבני אדם. טכניקה זו תאפשר לבדיקת תגובה תרופתית, גילוי של סמנים מולקולריים לאבחון, קביעת פרוגנוזה, והניטור של מחלות שונות, כגון מחלות מטבוליות, מחלות ניווניות וסוגים שונים של גידולים ממאירים.
לפיכך, אנו פיתחנו שיטה זעיר פולשנית לקבלת דם מדג הזברה סדרתי 15. כאן אנו מדגימים את הליך בחינה ויזואלית ולספק פרוטוקול מפורט לטכניקה זו. באמצעות שיטה זו, הערך הנורמלי המסתמך על פרמטרים שונים, בין המוגלובין, צום רמת סוכר בדם, ושומנים בדם של דג הזברה מבוגר בריאה הוערכו. בנוסף, אנחנו גם הערכנו האם שיטה זו מתאימה ללימודים שדורשים דגימות סידורי על ידי מ 'onitoring השינויים זמניים ברמות סוכר בדם במהלך ניסויי האכלת יתר.
אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לקבלת סדרתי דם מדג הזברה מבוגרת. שיטה זו היא פשוטה לביצוע ואנחנו משתמשים בו במעבדה על בסיס יומי. שיטת איסוף דם זה מבוססת על החדרת מחט נימי זכוכית לתוך אב העורקים הגב של דג הזברה. במהלך הליך זה, זה קריטי להיות זהיר כדי לא לקטוע את עמוד השדרה …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |