アダルトゼブラフィッシュにおける血液検査のための反復採血
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
反復採血は、動物実験で実行される最も一般的な技術の一つです。しかしながら、ゼブラフィッシュからの血液採取のための非致死プロトコルが確立されていません。ゼブラフィッシュからの採血のための従来の方法は、横切開、断頭とテールアブレーションとして、致死的です。したがって、私たちはここで小説「繰り返し」採血方法、および現在のこの手順を概説し、詳細なプロトコルを開発しました。この方法は、低侵襲性であるため、同じ個体から繰り返し採血を可能にする、ゼブラフィッシュのための非常に低い死亡率（2.3％）が得られます。採血の最大量は、魚の体重に依存します。間隔で繰り返し採血用のボリュームが血中ヘモグロビンの測定により評価した2週間毎に、体重の≤0.4％毎週または≤1％であるべきです。さらに、ヘモグロビン、空腹時血糖、血漿トリアシルグリセロール（TG）、総C男性と女性の大人のゼブラフィッシュにおけるholesterolレベルを測定しました。また、食餌性肥満におけるグルコース代謝の調節不全を調査するためにこの方法を適用しました。この血液採取法は、グルコースおよび脂質代謝およびヒト疾患モデル生物としてゼブラフィッシュの使用を増加させる血液学の研究を含む多くのアプリケーションを可能にします。
Introduction
その臓器や遺伝学は人間1,2と同様であるため、ゼブラフィッシュは、ヒト疾患の貴重なモデルとして増加し人気を集めています。発生生物学の分野では、多くの研究は、ゼブラフィッシュとヒトのショーは造血3、止血4,5、および骨髄造血6の類似性をマークしていることを実証しました。大人のゼブラフィッシュはまた、このモデル生物を共有ので、ヒトの疾患において破壊と共通の経路を免疫学7、神経変性8および肥満関連疾患9を研究するために使用されています。肥満及び肥満関連疾患（糖尿病、脂肪肝と非アルコール性脂肪肝炎およびアテローム性動脈硬化症）のために、ゼブラフィッシュ血糖および脂質のレベルは完全にいくつかのトランスジェニックおよび食餌性肥満モデル10-13に研究されてきました。
個々の動物からの反復採血は動物の使用量を削減し、12月になります個人間の違いをrease。しかし、繰り返しサンプルの収集は、その比較的少量の血液量と簡単にアクセス血管の欠如のようなゼブラフィッシュのような小動物では技術的に困難です。これらの方法は、自分の欠点を持っているが、ゼブラフィッシュからの1回の血液採取のためのいくつかの方法は、組織損傷および制限された血液量に関連する、致死性を含む、開発されています。例えば、1〜5μlの血液は背側大動脈5の領域の長さは0.3程度センチ横切開から収穫することができます。胸ガードルを切断することにより、はさみで断頭は、5〜10μlの血液10を収集することができます 。別の便利な採血方法は尾切除14です。心臓穿刺は、同じ魚から繰り返し採血のための1つの潜在的な代替方法ですが、この手順で取得した、非常に少量（約50 NL）はperforすることができます分析の数を制限11のmed。したがって、新しいプロトコルは、この生物はヒト疾患のための標準的なモデル生物であることをするために必要な重要な進歩となるであろう繰り返さ非致死性の血液サンプリングを、有効にするために必要とされています。この技術は、薬理学的応答、分子診断のためのバイオマーカー、予後の決意の発見、ならびに代謝性疾患、変性疾患および悪性疾患のいくつかの種類のような様々な疾患の監視を試験することを可能にします。
したがって、我々は、ゼブラフィッシュシリアル15から血液を得るための低侵襲的方法を開発しました。ここでは、視覚的に手順を示し、この技術の詳細なプロトコルを提供します。空腹時血糖、ヘモグロビンを含む様々なパラメータに基づいて、正常値をこの方法を用いて、そして健康な成人のゼブラフィッシュの血液中の脂質を評価しました。さらに、我々はまた、この方法は、mで一連の試料を必要とする研究に適しているかどうかを評価しましたオーバーフィード実験中血糖値の時間変化をonitoring。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、直列大人のゼブラフィッシュから血液を取得するための詳細なプロトコールを提示します。この方法は、実施するのは簡単であると私たちは日常的に研究室で使用します。この採血方法は、ゼブラフィッシュの背側大動脈にガラスキャピラリ針の挿入に基づいています。この手順の間、それは背側大動脈を検索するための基準であるため、脊椎を切除しないように注意することが?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
Riferimenti
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474 (2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -. P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
