성인 Zebrafish의에서 혈액 검사에 대한 반복 채혈
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
반복 채혈은 실험 동물에서 수행하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 그러나, 제브라 피쉬에서 채혈을위한 비 살상 프로토콜은 확립되어 있지 않다. 제브라 피쉬에서 혈액 수집에 대한 이전의 방법은 횡 절개, 잘린 꼬리 절제로, 치명적입니다. 따라서 우리는 여기에서이 절차를 요약 한 상세한 프로토콜을 소설 "반복"혈액 수집 방법을 개발하고, 존재했다. 이 방법은 침습적이고 따라서 동일인으로부터 반복 채혈이 가능 제브라위한 매우 낮은 사망률 (2.3 %)을 초래한다. 혈액 샘플링의 최대 볼륨은 물고기의 체중에 따라 달라집니다. 간격으로 반복 혈액 샘플링의 볼륨은 혈액의 헤모글로빈의 측정에 의해 평가 하였다 체중 매주 또는 ≤1 % 2 주마다의 ≤0.4 %이어야한다. 또한, 혈색소, 공복 혈당, 혈장 중성 지방 (TG), 총 C남성 및 여성 성인 holesterol 지브라 피쉬의 수준을 측정 하였다. 우리는 또한 다이어트 유발 된 비만에서 포도당 대사의 조절 곤란을 조사하기 위해이 방법을 적용했다. 이러한 혈액 수집 방법은 글루코스 및 지질 대사 및 인간의 질환 모델 생물로서 지브라 피쉬의 사용을 증가시킬 것이다 혈액 학적 연구를 포함하는 많은 애플리케이션을 허용 할 것이다.
Introduction
이들 장기 및 인간 유전학 1,2- 마찬가지이기 때문에 지브라 피쉬는 인간 질병의 유용한 모델로 증가 인기를 얻고있다. 발생 생물학의 분야에서 많은 연구는 제브라 피쉬와 인간의 쇼가 조혈 3, 지혈 4,5, 및 myelopoiesis 6 유사성을 표시 것을 증명하고있다. 성인 제브라 피쉬는이 모델 생물을 공유하기 때문에 인간의 질병에 혼란 그와 공통 경로를 면역 학적 7, 신경 퇴행성 8과 비만 관련 질병 (9)을 연구하는 데 사용됩니다. 비만 및 비만 관련 질환 (당뇨병, 간 지방증 및 비 알코올성 지방 간염 및 동맥 경화증), 제브라 피쉬 들어 혈당 및 지질 수준을 충분히 여러 형질 전환 및식이 유도 비만 모델 10-13에서 연구되었다.
개별 동물의 반복 채혈 동물 사용 및 12월을 줄일 수interindividual 차이를 rease. 그러나, 반복 된 시료 채취 때문에 상대적으로 작은 혈액량 쉽게 접근 용기의 부족 등 제브라 작은 동물에서 기술적으로 곤란하다. 이들 방법은 치사 포함 자신 단점을 가지고 있지만 제브라에서 일회성 채혈을위한 여러 방법이, 관련된 조직 손상 및 제한된 혈액량을 개발되어왔다. 예를 들어, 1-5 ㎕의 혈액 등쪽 대동맥 (5)의 영역의 길이는 약 0.3 cm의 횡 절개에서 수확 될 수있다. 팔 이음 뼈를 절단하여 가위로 잘린 5-10 μL 혈액 (10)를 수집 할 수 있습니다. 또 다른 편리한 혈액 샘플링 방법은 꼬리 어블 14이다. 심장 천자 동일한 물고기 반복 채혈을위한 하나의 잠재적 인 대안 방법이지만, 매우 소량이 절차 (약 50 NL)를 수득 할 수있다 perfor 분석의 수를 제한11 클럽 메드. 따라서, 새로운 프로토콜이 유기체는 인간의 질병을위한 표준 모델 생물하기 위해서는 중요한 미리 필요하다 반복적 치명적 혈액 샘플링을 가능하게하는데 필요하다. 이 기술은 약물 반응, 분자 진단용 바이오 마커, 예후 판정 발견과 같은 대사성 질환, 퇴행성 질환 및 악성 종양 등의 다양한 여러 종류의 질환의 모니터링을 테스트 할 수있다.
따라서 우리는 제브라 피쉬 직렬 15에서 혈액을 얻기위한 최소 침습적 방법을 개발했다. 여기에서 우리는 시각적으로 절차를 설명하고이 기술에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법을 사용하여, 다양한 파라미터를 포함 헤모글로빈, 공복 혈당 및 건강한 성인 지브라 피쉬의 혈중 지질에 기초하여 정상 값을 평가 하였다. 또한, 우리는 또한이 방법은 M에 의해 일련의 샘플을 필요로 연구에 적합한 지 여부를 평가과식 실험시의 혈당 변화를 시간적 onitoring.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 직렬 성인 제브라 피쉬에서 혈액을 얻기 위해 여기에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 수행하는 것이 간단하며 우리는 일상적 실험에 사용. 이러한 혈액 수집 방법에 지브라 피쉬의 등쪽 대동맥 내로 유리 모세관 바늘 삽입에 근거한다. 이 절차를 수행하는 동안, 그것은 지느러미 대동맥를 검색하기위한 기준이 있기 때문에 척추를 브레이션 않도록주의하는 것이 중요합니다. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
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