Colheita de sangue para testes repetidos de sangue em Zebrafish Adulto
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
Recolha de sangue é repetida uma das técnicas mais comuns realizados em animais de laboratório. No entanto, um protocolo não-letal para a recolha de sangue do peixe-zebra não foi estabelecida. Os métodos anteriores para a recolha de sangue a partir de peixe-zebra são letais, tais como incisão lateral, decapitação e ablação cauda. Assim, temos desenvolvido um novo método de recolha de sangue "repetida", e aqui presente um protocolo detalhado descrevendo esse procedimento. Este método é minimamente invasivo e resulta em uma taxa de mortalidade muito baixo (2,3%) para peixe-zebra, permitindo, assim, a amostragem de sangue repetidas do mesmo indivíduo. O volume máximo de recolha de amostras de sangue é dependente do peso do corpo do peixe. O volume de sangue para a amostragem repetida em intervalos deve ser ≤0.4% de peso corporal por semana ou ≤1% a cada 2 semanas, que foram avaliadas por medições de hemoglobina no sangue. Além disso, a hemoglobina, glicemia de jejum, triglicerídeos plasma (TG) e total cníveis holesterol em peixe-zebra adulto masculino e feminino foram medidos. Nós também aplicaram esse método para investigar a desregulação do metabolismo da glicose na obesidade induzida por dieta. Este método de coleta de sangue permitirá que muitas aplicações, incluindo glicose e metabolismo lipídico e estudos hematológicos, o que aumentará o uso de peixe-zebra como um modelo de doença organismo humano.
Introduction
Zebrafish estão ganhando cada vez mais popularidade como um valioso modelo de doenças humanas porque os seus órgãos e genética são semelhantes aos dos seres humanos 1,2. No campo da biologia do desenvolvimento, muitos estudos têm demonstrado que o peixe-zebra e mostrar humana marcada semelhança na hematopoiese 3, hemostasia 4,5, e 6 myelopoiesis. Peixe-zebra adulto também são usados para o estudo imunológico 7, 8 e neurodegenerativa doenças relacionadas à obesidade 9 porque este ações organismo modelo vias comuns com aqueles interrompido em doenças humanas. Para obesidade e doenças relacionadas à obesidade (diabetes, esteatose hepática não alcoólica e e esteatohepatite aterosclerose), glicemia peixe-zebra e níveis de lipídeos, foram exaustivamente investigados em vários modelos de obesidade transgênicos e induzida por dieta 10-13.
Coleta de sangue repetidas de animais individuais irá reduzir o uso de animais e dezembroRease diferenças interindividuais. No entanto, a recolha repetida de amostra é tecnicamente difícil em pequenos animais, tais como peixe-zebra por causa do seu volume de sangue relativamente pequena e a falta de vasos facilmente acessíveis. Vários métodos para a recolha de sangue de uma só vez a partir de peixes-zebra foram desenvolvidos, embora estes métodos têm os seus próprios inconvenientes, incluindo a letalidade, danos nos tecidos associados e volume de sangue limitado. Por exemplo, 1-5 mL de sangue pode ser colhido a partir de uma incisão lateral de aproximadamente 0,3 cm de comprimento na região da aorta dorsal 5. Decapitação com uma tesoura de cortar o cinto peitoral pode coletar 5-10 ul sangue 10. Outro método de amostragem de sangue conveniente é a ablação da cauda 14. Punção cardíaca é um potencial método alternativo para a coleta de sangue repetidas do mesmo peixe, mas a quantidade muito pequena obtida (aproximadamente 50 nl) com este procedimento limita o número de análises que podem ser performed 11. Por conseguinte, um novo protocolo é necessário para permitir a recolha de amostras de sangue não letal repetida, o que seria um avanço crítico necessário para este organismo ser um organismo modelo padrão para doenças humanas. Esta técnica permitiria testar resposta farmacológica, a descoberta de biomarcadores moleculares para o diagnóstico, determinação do prognóstico e do acompanhamento de várias doenças, tais como doenças metabólicas, doenças degenerativas e vários tipos de doenças malignas.
Assim, desenvolvemos um método minimamente invasivo para a obtenção de sangue de peixe-zebra em série 15. Aqui demonstramos o procedimento visualmente e fornecer um protocolo detalhado para esta técnica. Usando este método, foram avaliados o valor normal com base em vários parâmetros, incluindo a hemoglobina, glicemia de jejum, e lipídios no sangue de peixe-zebra adultos saudáveis. Além disso, também avaliamos se esse método é apropriado para estudos que exigem amostras de série por mONITORIZAÇÃO as mudanças temporais nos níveis de glicose no sangue durante as experiências superalimentação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado para a obtenção de sangue em série a partir de peixe-zebra adulto. Este método é simples de realizar e usá-lo no laboratório, numa base diária. Este método de coleta de sangue é baseada na inserção de uma agulha capilar de vidro em aorta dorsal do peixe-zebra. Durante este procedimento, é crítico para ter o cuidado de não fazer a ablação da coluna porque é o critério para a busca de aorta dorsal. Reduzir a lesão da coluna irá melhorar a taxa de sobreviv?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
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