Upprepad Blood Collection för Blodprov i vuxen Zebrafish
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
Upprepad blodinsamling är en av de vanligaste teknikerna som utförs på försöksdjur. Emellertid har en icke-dödlig protokoll för blodinsamling från zebrafisk inte fastställts. De tidigare metoder för blodinsamling från zebrafisk är dödliga, såsom lateral snitt, halshuggning och svans ablation. Därmed har vi utvecklat en ny "upprepade" bloduppsamlingsmetod och närvarande här ett detaljerat protokoll som beskriver denna procedur. Denna metod är minimalt invasiva och resulterar i en mycket låg dödlighet (2,3%) för zebrafisk, vilket möjliggör upprepad provtagning av blod från samma individ. Den maximala volymen av blodprovtagnings är beroende av kroppsvikten hos fisken. Volymen för upprepad blodprov med jämna mellanrum bör vara ≤0.4% av kroppsvikten varje vecka eller ≤1% var 2 veckor, vilket bedömdes genom mätning av blodhemoglobin. Dessutom, hemoglobin, fasteblodglukos, plasma triacylglycerol (TG) och totalt cholesterol nivåer i manliga och kvinnliga vuxna zebrafisk mättes. Vi ansökte även denna metod för att undersöka dysreglering av glukosmetabolismen i dietinducerad övervikt. Detta blod insamlingsmetod gör det möjligt för många tillämpningar, inklusive glukos och lipidmetabolism och hematologiska undersökningar, vilket kommer att öka användningen av zebrafisk som en mänsklig sjukdom modellorganism.
Introduction
Zebrafisk får allt större popularitet som en värdefull modell för mänskliga sjukdomar eftersom deras organ och genetik liknar dem hos människor 1,2. När det gäller utvecklingsbiologi, har många studier visat att zebrafisk och mänsklig show märkt likhet i hematopoies 3, hemostas 4,5 och myelopoes 6. Vuxna zebrafisk används också för att studera immunologiska 7, neurodegenerativa 8 och fetmarelaterade sjukdomar 9 eftersom denna modell organism delar densamma som vid de störs i mänskliga sjukdomar. För fetma och fetmarelaterade sjukdomar (diabetes, leversteatos och nonalcoholic steatohepatitis och ateroskleros), zebrafisk blodsocker och lipider nivåer har undersökts grundligt i flera transgena och kost inducerad fetma modeller 10-13.
Upprepad blodprov från enskilda djur kommer att minska användningen djur och decemberrease skillnader mellan individer. Men är tekniskt svårt i små djur såsom zebrafisk upprepade provsamling på grund av deras relativt liten blodvolym och bristen på lättillgängliga fartyg. Flera metoder för en-gång bloduppsamlings från zebrafisk har utvecklats, även om dessa metoder har sina egna nackdelar, inklusive letalitet, tillhörande vävnadsskada och begränsad volym blod. Till exempel kan 1 till 5 | il blod skördas från en lateralt snitt av approximativt 0,3 cm i längd i området för det dorsala aortan 5. Halshuggning med en sax genom att skära genom skuldergördel kan samla 5-10 il blod 10. En annan lämplig blodprovtagningsmetod är svans ablation 14. Hjärtpunktur är ett potentiellt alternativ metod för upprepad uppsamling av blod från samma fisk, men mycket små belopp som erhålls (ca 50 nl) med detta förfarande begränsar antalet analyser som kan vara utför litenMed 11. Följaktligen behövs ett nytt protokoll för att möjliggöra upprepad icke-dödande blodprovstagning, vilket skulle vara en avgörande framsteg som krävs för denna organism vara en standardmodellorganism för mänskliga sjukdomar. Denna teknik skulle möjliggöra att testa farmakologiska svar, upptäckt av molekylära markörer för diagnos, bestämning av prognos samt övervakning av olika sjukdomar, såsom metaboliska sjukdomar, degenerativa sjukdomar och flera typer av maligniteter.
Vi utvecklade därför en minimalinvasiv metod för att erhålla blod från zebrafisk serie 15. Här kan vi visa förfarandet visuellt och ger ett detaljerat protokoll för denna teknik. Med den här metoden, var normalvärdet baseras på olika parametrar, inklusive hemoglobin, fasteblodglukos och lipider i blodet hos friska vuxna zebrafisk utvärderas. Dessutom utvärderade vi även om denna metod är lämplig för studier som kräver seriella prover från mÖVERVAKNING de temporala förändringar i blodglukosnivåer under övergödning experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterar här ett detaljerat protokoll för seriellt erhålla blod från vuxna zebrafisk. Denna metod är enkel att utföra och vi använder den i labb på daglig basis. Denna bloduppsamlings metod är baserad på att föra in en glaskapillär nål i zebrafisk s dorsala aortan. Under denna procedur, är det viktigt att vara noga med att inte avlägsna ryggraden eftersom det är kriteriet för att söka efter rygg aorta. Minska ryggraden skadan kommer att förbättra överlevnaden. Även om denna teknik är enkel o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
Riferimenti
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474 (2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -. P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
