Essai in vitro pour mesurer Phosphatidyléthanolamine Methyltransferase activité

Summary

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Abstract

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

Introduction

Phosphatidyléthanolamine méthyltransférase (OGERP) enzymes catalysent la fixation covalente d'un ou plusieurs des groupes méthyle à l'aide de S -adenosylmethionine (SAM) comme le groupe méthyle donneur sur PE, monométhyl-PE ou diméthyl-PE pour donner monométhyl-PE, le diméthyl-PE et / ou phosphatidylcholine (PC). Ces enzymes sont presque omniprésents dans les cellules animales et les champignons. Ils peuvent également être trouvés dans des plantes ^{1 et} environ 10% des bactéries, en particulier celles qui interagissent avec les eucaryotes ^2.

PEMTs correspondant à la biologie de la cellule, non seulement en contribuant à la production de PC, qui est la principale classe de lipides dans les cellules animales, mais aussi en remplissant d'autres fonctions cellulaires importantes. Chez les mammifères, PEMTs sont principalement exprimés dans le foie où ils sont nécessaires pour la sécrétion normale de la lipoprotéine de très basse densité et ils contribuent également à l'obésité induite par l'alimentation ^{3, 4} athérosclérose, et l'insuline résistentance ^5. En outre, OGERP mammifères sont également exprimée dans les adipocytes, mais à des niveaux inférieurs, et de participer à des dépôts de graisse ^{6, 7.} OGERP rôle dans le développement du cancer ^{8, 9} apoptose, et ¹⁰ de la croissance cellulaire a également été démontrée. Chez les bactéries, les enzymes OGERP se sont révélés être importants pour la croissance normale de la cellule ^{2, 2} virulence, et symbiose avec la plante hôte ^11.

Le but et la justification du présent Protocole est de mesurer l'activité OGERP à partir d'extraits de cellules entières, sans la nécessité de purifier l'enzyme. Deux protocoles distincts ont été développés pour mesurer l'activité OGERP. La première et la plus commune mesure le transfert d'un groupe méthyle tritiée de SAM radioactifs sur PE, qui est le sujet de cet article. Ce protocole a été développé à l'origine pour mesurer l'activité de la levure OGERP ^{12 et} des cellules de mammifères (foie) ¹³ pour obtenir un understanding biosynthèse de PC dans ces cellules ainsi que pour déterminer la spécificité de ces enzymes. Par la suite, cette technique a été appliquée à d'autres types tels que des bactéries de cellules ⁽² à l'aide d'une valeur de pH basique pour le dosage si ¹⁵⁾ et des protozoaires parasites ^14. Cette technique peut être utilisée avec des extraits de cellules entières, ainsi que l'enzyme purifiée, et peut potentiellement être appliqué à tout système d'extrait cellulaire. Un essai non radioactif a également été conçu qui repose sur la quantification enzymatique de -adenosylhomocysteine ​​S, le produit de transméthylation de ¹⁶ SAM. Ce dernier dosage peut être plus pratique, car elle ne comporte pas de radioactivité, mais elle ne convient que pour des enzymes purifiées.

Protocol

Extrait 1. Préparation des cellules Cultiver les cellules de Leishmania dans une bouteille en plastique stérile scellé avec chapeau d'air étanche à 26 ºC dans un milieu en 1x M199 supplémenté avec 20 mM HEPES pH 7,4, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine, 5 ug / ml hème , 0,35 g / L NaCO 2 H, mM adénine 0,1 et 2 ng / ml bioptérine sans agitation. Récolter les cellules par centrifugation à 1500 g pendant 5 min à 4 ° C quand ils atteignent une densité c…

Representative Results

La figure 1 montre un dosage de OGERP dépendant du temps, qui a été réalisée avec Leishmania extrait de cellules entières comme source d'enzyme endogène PE en utilisant comme substrat. La quantité de radioactivité dans la phase organique a été quantifiée par comptage par scintillation. Les chiffres obtenus ont été utilisés pour calculer le montant de groupes méthyle tritiatés transférés sur PE. L'activité de OGERP était linéaire pen…

Discussion

Ce dosage de OGERP simple, rapide permet la quantification des formes méthylées de PE qui résulte du transfert de groupes méthyle de SAM sur radioactives PE en utilisant un extrait de cellules entières en tant que source de protéine. Il est rapide, sensible, reproductible, et également adapté pour ¹⁷ des enzymes purifiées. Monométhylique ou diméthylique-PE peuvent être ajoutés à l'essai si la méthyltransférase d'intérêt est spécifique de ces substrats au lieu de PE ^{12,13,18,19….}

Materials

S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (specific activity of 5-15 Ci/mMole)	Perkin Elmer	NET155050UC	Aliquot the reagent and freeze at -20 °C; follow radiation safety guidelines while using this reagent
Protease inhibitor cocktail	Roche Life Sciences	11836170001	dilute it fresh
Glass beads, acid washed, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Bicinchoninic acid solution	Sigma Aldrich	B9643
Copper (II) sulfate	Sigma Aldrich	C2284
Scintillation counter MicroBeta2 with 1-detector	Perkin Elmer	2450-0010
Spectrophotometer Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA stock solution (10 mg/ml)	New England Biolabs	B9001S
Scintillation liquid	Research Product International Corp	111198
S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)	Cayman Chemicals	13956	dilute the reagent in 20 mM HCl and freeze aliquots at -80 °C