정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Summary

이 프로토콜은 마우스 폐 조직 내에서 전이를 나타내는 특정 종양 세포의 mRNA를 검출하도록 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)을 사용하는 방법을 설명한다.

Abstract

전이성 질환 먼 기관에 차 암 사이트에서 악성 종양 세포의 확산된다 암 관련 사망의 ¹ 차 원인이다. 전이성 확산의 일반적인 사이트는 폐, 림프절, 뇌, 뼈 ^(2)를 포함한다. 전이를 구동 메커니즘은 암 연구의 강렬한 영역입니다. 전이 먼 사이트는 암 연구를위한 수단이다에 따라서, 효과적인 분석은 전이성 부담을 측정합니다. 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가는 일반적으로 다음 해부 폐 조직의 육안 관찰에 의해 정성 행한다. 전이를 평가하는 정량적 방법은 현재 생체 외 및 사용자 정의 된 매개 변수를 필요로 생체 내 이미징 기반 기술에 제한됩니다. 이들 기술의 대부분은 오히려 세포 수준 ^3-6보다 전체 유기체 수준이다. 다 광자 현미경을 이용하여 새로운 이미징 방법 METAS을 평가할 수 있지만세포 수준에서 ⁷ TASIS이 매우 우아한 절차는 보급의 메커니즘보다는 전이성 부담의 정량적 평가를 평가에 더 적합하다. 여기에 정량적으로 전이를 평가하는 간단한 체외 방법이 제공된다. 정량 실시간 PCR을 사용하는 것은 (QRT-PCR), 특정 종양 세포의 mRNA는, 마우스 폐 조직 내에서 검출 될 수있다.

Introduction

QRT-PCR 분석은 종양 전이를 평가하는 방법으로서 제안되어있다. 이 방법은 전이를 평가 관련되지만, 생체 내 이미징 장치 또는 형광 할 입체경 특정 장비에 액세스 할 수없는 사용자를위한 대안으로 제시된다. 일반적으로 사용되는 방법의 논의는 QRT-PCR 분석은 별개로 또는 전이를 평가하는 방법에 동반하여 사용할 수있는 방법에 대한 데모 뒤에 제공된다. 이 절차는 전이성 부담의 정량 분석​​을 제공하는 잠재력을 가지고있다.

실체 현미경하에 폐의 시각화뿐만 아니라 헤 마톡 실린 및 에오신 다음 직렬 절편을 포함하여 총 분석의 표준 방법은 폐 조직의 (H & E) 염색, 정량화하지만 ^2-5 계산을위한 사용자 정의 된 매개 변수에 크게 의존하고있다. 실체 현미경을 사용하여 전체 폐를 평가할 때, 단지 큰 표면 전이는 VISI은BLE 및 분석은 전이성 병변을 구성하는 것을 결정하기 위해 폐 해부학 적 구조의 합리적인 지식을 가지고 조사를 필요로한다. 이러한 GFP 적절한 여기 / 방출 최대 (GFP 예 : 근처 510분의 470 ㎚)와 빛 큐브를 포함하는 입체 현미경의 사용과 같은 마커로 종양 세포의 형광 라벨은이 과정에서 지원,하지만 표면의 종양 결절은 탐지 가능 . 또한, GFP와 같은 매개 변수 아래에 표시되는 혈액의 오염에서 형광이 가능 전이성 병변의 거짓 식별 될 수 있습니다.

폐 전이를 시각화하기 위해 H & E 염색 한 다음 폐의 단면은 미세 전이와 면역 세포의 침윤을 포함한 다른 마이크로 프로세스를 평가하는 유용한 방법이지만 종종 파라핀 삽입, 절편 및 염색 절차는 전체 폐 조직의 사용을 필요로한다. 따라서, 다운 스트림 절차는이 운전 방식 다음과 같은 이상 없습니다디. 정량화하지만,이 과정은 분석이 폐의 전체 3 차원 구조를 차지하도록 동물 당 염색 폐 구간의 다수를 평가하는 조사원을 필요로한다. 결과적으로, 시험이 유형의 에러를 카운트로 이어질 수 있고, 시간 소모적이며, 분석은 연구자의 판단에 크게 의존한다.

(MRI는 PET, SPECT는 예) 현재 수행하거나 실험 쥐 모델 ⁸ 생물학적 과정을 테스트하는 데 사용되는 생체 내 이미징 기술의 몇 가지. 생체 내 생물 발광 영상은 전이 ^(9)의 총보기를 취득하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 일반적으로 인해 종양 세포 주입 후 유선 및 자발적 전이시 폐 같은 특정의 장기에 상주하는 루시퍼 라제 반응 요소를 포함하도록 설계되는 종양 세포의 축적에 루시페라아제 리포터 활성의 존재를 평가하기 위해인가 ¹루시페라아제 리포터 활성의 0. 시각화는 루시페린 기판 (D-루시페린)의 존재에 의해 유도된다. 루시 페라 제는 생물 발광을 생성 oxyluciferin하는 D-루시페린의 산화 적 탈을 촉매. 정보 있지만,이 방법은 기판의 안정성 (즉, 짧은 반감기)이 실험 동물에 전달되는 방법에 따라 달라집니다 기판의 적절한 분배, 및 탐지 ^(9)의 낮은 감도 등 여러 가지 요인에 의해 제한됩니다. 이 기술에 주요 장점은, 비 침습적 인 살아있는 동물에서 수행 될 수 있고, 일반적으로 절개 ^9,10- 수확되지 않았을 수있는 다수의 기관에서 종양 세포의 전이의 검출을 초래할 수 있다는 것이다.

생체 영상 기술의 일 측면은 양성 폐 조직 파라핀 등에 매립 이차 절차 허용 흐트러 그대로 또는 여기 제시 QRT-PCR 분석한다는 것이다. 그러나, QRT-PCR은 theoretica이기 때문이다에서야 검출 더 민감한 법안은 총 평가는 폐에 존재하는 종양 세포의 낮은 숫자를 공개하지 않을 수 있습니다. 유용한 반면, 상기 이미징 기술은 치환 될 수 있거나, 현재 설명 QRT-PCR 방법으로 보충. QRT-PCR은 폐에서 종양 유래의 mRNA의 민감한 측정을 제공하는 잠재력을 가지고있다.

Protocol

이 프로토콜은 가이드 라인과 사우스 캐롤라이나 (MUSC)과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 의과 대학 (IACUC)의 동물 보호 기준을 따른다. 1. 폐 해부 유방 종양 절제술 (선택 연구 목표 및 기본 종양 분석 또는 꼬리 정맥 주입이 수행 여부에 따라). IACUC 대학 규정에 따라 이소 플루 란 마취의 치사량을 사용하여 마우스를 안락사. 수술 전위에 의해 euthanization을 확인합니다. …

Representative Results

시간을 초과가 실험 동물 내로하면 종양 세포의 초기 접종을 수행하는 데 걸리는 행하는, 생체 내 종양 분석, 조직 수확 RNA 분리 및 QRT-PCR 분석에 기본이 1-2 일 과정이다 (도 1) . 총 분석의 예는 폐 조직 내에서 종양 세포를 평가하기위한 생물 발광 이미징이다. 여기서, 유방 종양 실험은 ACT1라는 갭 정…

Discussion

이 프로토콜은 이종 이식 된 마우스 모델을 이용하여 폐에 유방 종양 세포 전이를 평가 QRT-PCR의 용도를 설명한다. 그것은 생물 발광 영상을 포함한 다른 기술, 사용할 수 있으며, 또한 자신의 가치와 한계에도 불구하고 전이를 검출하는 효과가 있음을 인정한다. 제시된 데이터는 QRT-PCR 총 전이 정량 폐 조직 내 종양 유래의 mRNA를 검출하는 효과적인 조치를 제공하는 것이 제안한다. 그것은 QRT-PCR 분…

Materials

2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG