Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR) verwenden, um Tumorzellen spezifische mRNA, die Metastasen in der Maus Lungengewebe zu erkennen.
Abstract
Metastasen ist die Verbreitung von bösartigen Tumorzellen aus dem Primärkrebs Website zu einem entfernten Orgel und ist die Hauptursache von Krebs Tod 1. Gemeinsame Standorte Metastasierung sind Lunge, Lymphknoten, Gehirn und Knochen 2. Mechanismen, die Metastasen zu fahren sind intensiv Bereichen der Krebsforschung. Folglich effektiven Tests, um metastatic Belastung zu messen in entfernten Stellen von Metastasen sind maßgeblich für die Krebsforschung. Bewertung der Lungenmetastasen in Mammatumor-Modellen wird im allgemeinen grob qualitative Beobachtung von Lungengewebe nach Dissektion durchgeführt. Quantitative Methoden zur Bewertung der Metastasierung sind derzeit auf ex vivo- und in vivo-Bildgebungstechniken, die auf Basis benutzerdefinierter Parameter erfordern beschränkt. Viele dieser Techniken sind in den gesamten Organismus Ebene als zellulärer Ebene 3-6. Obwohl neuere bildgebende Verfahren, die Multi-Photonen-Mikroskopie in der Lage, metas bewertenTASIS auf zellulärer Ebene 7 sind diese sehr elegante Verfahren besser geeignet für die Beurteilung Mechanismen der Verbreitung statt quantitative Bewertung der metastatischen Last. Hier wird ein einfaches in vitro-Verfahren für die quantitative Erfassung der Metastasierung wird vorgestellt. Mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) kann tumorzellspezifischen mRNA in der Maus-Lungengewebe nachgewiesen werden.
Introduction
QRT-PCR-Analyse als ein Verfahren zur Beurteilung der Tumormetastasierung vorgeschlagen. Dieses Verfahren wird als eine Alternative für die Nutzer, die sich für die Bewertung der Metastasierung sind, aber keinen Zugriff auf bestimmte Geräte wie in vivo bildgebenden Geräten oder einem Fluoreszenz fähig Stereoskop vorgeschlagen. Eine Diskussion der am häufigsten verwendeten Verfahren wird durch eine Demonstration, wie qRT-PCR-Analyse kann entweder als getrennte oder als Begleiter Verfahren zur Metastasierung auszuwerten dieser genutzt werden können gefolgt. Dieses Verfahren hat das Potenzial, eine quantitative Analyse von metastatischen Last bereitzustellen.
Standardverfahren der Brutto-Analyse, einschließlich der Visualisierung der Lunge unter einem Stereomikroskop sowie Serienschnitt gefolgt von Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung von Lungengewebe, quantifizierbar sind, sondern verlassen sich stark auf benutzerdefinierte Parameter zum Zählen 2-5. Bei der Bewertung der gesamten Lunge mit einem Stereomikroskop, nur große Oberfläche Metastasen sind visiBLE und Analyse erfordert die Prüfer, angemessene Kenntnisse der Lungen anatomischen Struktur, um festzustellen, was eine metastatische Läsion haben. Fluoreszenzmarkierung von Tumorzellen mit einem Marker, wie GFP und die Verwendung eines Stereomikroskops, das eine Licht Würfel mit dem geeigneten Anregungs- / Emissionsmaxima (zB in der Nähe von 470/510 nm für GFP) enthält hilft bei diesem Verfahren jedoch nur Oberflächentumorknötchen nachweisbar . Zusätzlich Fluoreszenz von Blutkontamination, die unter den gleichen Parametern wie GFP sichtbar ist, kann zu falschen Identifizierung möglicher Metastasen führen.
Schneiden der Lunge, gefolgt von H & E-Färbung auf Lungenmetastasen zu visualisieren ist eine nützliche Methode, um Mikrometastasen und anderen mikroskopischen Verfahren, einschließlich Immunzellinfiltration zu bewerten, sondern erfordert oft den Einsatz des gesamten Lungengewebe für die Paraffineinbettung, Schneiden und Färbeverfahren. Daher folgt dieser metho sind nachgeschalteten Verfahren nicht ideald. Obwohl quantifizierbaren, erfordert dieses Verfahren den Forscher eine Vielzahl von gefärbten Lungenschnitten pro Tier bewerten, um sicherzustellen, dass die Analyse berücksichtigt die gesamte 3D-Struktur der Lunge. Somit ist diese Art der Untersuchung zeitaufwendig, können Zählfehler zu führen, und die Analyse stützt sich stark auf Ermittler Diskretion.
Mehrere in vivo bildgebenden Verfahren (zB MRT, PET, SPECT) werden gegenwärtig verwendet, durchzuführen oder zu testen, biologische Prozesse in experimentellen Tiermodellen 8. In vivo Biolumineszenz-Bildgebung ist eine gängige Methode verwendet, um eine grobe Ansicht von Metastasen 9 zu erwerben. Diese Technik wird im allgemeinen angewandt, um die Anwesenheit von Luciferase-Reporteraktivität zu beurteilen aufgrund der Akkumulation von Tumorzellen, die dazu entworfen sind, um eine Luciferase-Reaktionselement enthält, die in bestimmten Organen wie der Brustdrüse nach der Tumorzellimplantation und der Lunge, bei einer spontanen Metastasierung aufzuhalten 10. Visualisierung der Luciferase-Reporteraktivität durch die Anwesenheit von Luciferin-Substrat (D-Luciferin) induziert. Luciferase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von D-Luciferin zu Oxyluciferin Erzeugen Biolumineszenz. Während informative wird dieses Verfahren durch mehrere Faktoren, einschließlich Substratstabilität (dh kurze Halbwertszeit), eine angemessene Verteilung des Substrats, wie sie an Versuchstiere geliefert wird, hängt, und geringe Nachweisempfindlichkeit 9 begrenzt. Ein Haupt Vorteil dieser Technik ist, dass sie nicht invasiv ist, kann an lebenden Tieren durchgeführt werden und kann auf den Nachweis von Tumorzellmetastasen in verschiedenen Organen, die nicht normal zu Dissektion 9,10 geerntet führen kann.
Ein positiver Aspekt der in vivo bildgebenden Verfahren ist, dass das Lungengewebe ungestört so dass für sekundäre Eingriffe wie Paraffineinbettung oder wie hier, QRT-PCR-Analyse vorgestellt. Da jedoch QRT-PCR ist theoretically ein empfindlicheres Maß für die Erkennung, kann grobe Auswertung nicht verraten geringe Zahl von Tumorzellen in der Lunge vorhanden. Zwar nützlich, können die oben beschriebenen Bildgebungstechniken ersetzt oder die unmittelbar beschriebene qRT-PCR-Verfahren ergänzt werden. QRT-PCR hat das Potential, ein empfindliches Maß tumorderivierten mRNA innerhalb einer Lunge bereitzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt Verwendung von QRT-PCR, um Brust Metastasierung von Tumorzellen in die Lunge mit einem Xenograft Mausmodell zu bewerten. Es wird anerkannt, dass andere Techniken, einschließlich Biolumineszenz-Bildgebung zur Verfügung und sind auch wirksam zum Erfassen Metastasierung obwohl ihre eigenen Werte und Grenzen. Die vorgestellten Daten zeigen, dass qRT-PCR stellt eine wirksame Maßnahme zum Nachweis von Tumor-abgeleitete mRNA im Lungengewebe zur Quantifizierung von Gesamt Metastasierung. Es wird v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Yeh Labor wird durch Forschungsmittel von einem American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) von einem Department of Defense Zuschuss an die Hollings Cancer Center an MUSC verliehen, durch Forschungsförderung (W81XWH-11-2- unterstützt 0229) bei MUSC und von einem preis vom Concern Foundation (zum ESY).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation Kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25636 | |
| PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25716 | |
| gapdh Primer Sequence | For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
Riferimenti
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