Флуоресценции и Биолюминесценция изображений субклеточных Ca<sup> 2+</sup> У пожилых нейронов гиппокампа
Summary
Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.
Abstract
Восприимчивость к гибели клеток нейрон, связанный с нейродегенерацией и ишемии чрезвычайно увеличился в возрасте мозга, но механизмы, ответственные плохо известны. Эксайтотоксичность, процесс полагают, способствует повреждению нейронов, вызванной обоих инсультов, опосредовано активацией глутаматных рецепторов, что способствует притоку Ca2 + и Ca 2+ митохондриальной перегрузки. Существенное изменение внутриклеточного Ca 2+ гомеостаза или реконструкции внутриклеточного Ca 2+ гомеостаза нейронов может способствовать повреждению нейронов в старых. Для исследования Са 2+ ремоделирования в процессе старения мы использовали изображений живых клеток в долгосрочных культурах гиппокампа крысы нейронов, которые напоминают в некоторых аспектах в возрасте нейроны в естественных условиях. Для этого, гиппокампа клетки, в первую очередь, недавно разошлись с новыми родился крыс гиппокампе и высевали на поли-D-лизин покрытием, покровные стекла. Затем культуры хранятся в контролируемой средах в течение нескольких дней или нескольких шEEKs для исследования молодых и старых нейронов, соответственно. Во-вторых, культивируемые нейроны загружены фура2 и подвергали измерениям цитозольном Ca 2+ концентрации с использованием цифровых изображений отношение флуоресценции. В-третьих, культивируемые нейроны трансфицировали плазмидами, выражающих тандем низкоаффинных акворина и GFP, ориентированные на митохондрии. Через 24 часа, экворин внутри клеток восстанавливают коэлентеразином и нейроны подвергали визуализации биолюминесценции для контроля митохондриальной Ca 2+ концентрации. Это три шага процедура позволяет контролировать цитозольного и митохондриальных ответов Ca 2+ в соответствующих стимулов как, например, агонист рецептора NMDA глутамата и сравнить ли эти и другие ответы влиянием старения. Эта процедура может привести к новому пониманию того, как старение влияние цитозольных и митохондриальных ответов Ca 2+ в выбранных раздражителей, а также тестирование некоторых лекарственных препаратов, направленных на предотвращение нейронов клеткисмерть в возрастных заболеваний.
Introduction
Эксайтотоксичность является одним из наиболее важных механизмов, способствующих повреждению нейронов и гибели клеток в неврологических инсультов, таких как ишемия, а в некоторых нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера 1. Этот тип нейротоксичности в основном при посредничестве глутамата, действующего на Ca 2+ -permeable, рецепторы NMDA ионотропический (NMDAR) 2. Воздействие культивируемых нейронов на глутамат может привести к эксайтотоксичности 3, который вызывает апоптоза нейронов 4. Мы и другие, ранее сообщалось, что нейронная уязвимость к апоптозу NMDA-индуцированной может измениться с развитием в пробирке и старения 5-8.
Это широко признано, что увеличение цитозольной без Ca 2+ концентрации ([Са 2+] цит) приводит к активации клеток. Однако, если этот подъем является слишком высокой и / или замедленным достаточно, это может вызвать гибель клеток 9. Кроме того, было предложеночто эксайтотоксичность требует митохондриальную Са 2+ поглощения 10, так как нейроны лечения с митохондриальной разобщающий охраняемых нейронов против индуцированной глутаматом гибели клеток 11. Если митохондрии занимают слишком много Са 2+, открытие митохондриальной проницаемости перехода поры может произойти, ведущих к выпуску цитохрома с и других про-апоптотических факторов, и индукции апоптоза. Мы недавно показали, что это митохондриальная Са 2+ поглощение непосредственно связано с возрастной зависит восприимчивость к эксайтотоксичности, путем непосредственного измерения NMDA-индуцированной митохондриальной Ca 2+ поглощение в отдельных нейронах гиппокампа 5, метод, который сообщается в этой статье. Гиппокамп, участвует в физиологических процессах, таких как обучение, память и другие когнитивные процессы 12, весьма уязвима к старению и нейродегенеративных расстройств 13. Было предложено, что после нескольких недель в пробирке, культивируемыхнейронов гиппокампа показать ряд характерных особенностей в возрасте 14 нейронов. Соответственно, долгосрочные культивированный нейронов гиппокампа может обеспечить комплексную модель для исследования Ca 2+ опосредованной механизмов повышения эксайтотоксичности в старении.
Общая цель метода, изложенного, следовательно, исследовать существенные изменения внутриклеточного Ca 2+ гомеостаза Са 2+ или реконструкции в том числе старение мозга дифференциальных Ca 2+ ответов, вызванных NMDA рецепторов агонистов через долгосрочных культурных нейронов гиппокампа , Способ включает подробное описание культуры нейронов гиппокампа крысы и мониторинга цитозольных и митохондриальных концентрации Ca 2+ с помощью флуоресцентной визуализации и биолюминесценции в отдельных нейронов, соответственно. Флуоресценции визуализации цитозольными Ca 2+ в культивируемых нейронов является стандартной процедурой. Тем не менее, этот метод является менее надежным для субсотовая Са 2+ измерения, включая митохондриальной Ca 2+. Причины для этого включают в себя отсутствие адресности синтетических зондов и ненадлежащего сродством к концентрации Са 2+, которые могут изменяться в митохондриях из-за низкого уровня мкМ даже до уровня мм. Использование Ca 2+ зондами на основе белков, как, например, акворина, позволило ориентации на субклеточных органелл и использование производных различных Ca 2+ сродства с использованием различных coelenterazines или мутировавших зонды отсутствует специальное Ca 2+ сайты связывания 15. Таким образом, биолюминесценции визуализации клеток, экспрессирующих митохондрий, ориентированных экворин может позволить мониторинг митохондриальных Ca2 + концентрации в отдельных нейронов. Тем не менее, эта процедура может потребовать использования фотонных счетных камер или камер сверхчувствительных ПЗС для биолюминесценции визуализации 16-18. Этот метод может дать новые результаты, которые должны быть подтверждены более были обванного модели старения мозга, как, например, кусочки мозга от старых животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модернизации внутриклеточного Ca 2+ гомеостаз в стареющем мозге была связана с познавательной потери, повышенную восприимчивость к ишемии, эксайтотоксичности и нейродегенеративные. Чтобы исследовать эту гипотезу в пробирке, процедуры отображения Ca 2+ доступны. К с…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Ministerio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Leòn (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Brûlet (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.
Materials
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
Riferimenti
- Sattler, R., Tymianski, M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).
- MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones. Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).
- Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).
- Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).
- Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium. Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).
- Liu, Y., et al. NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).
- Zhou, M., Baudry, M. Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).
- Brewer, L. D. Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels. Brain Research. 1151, 20-31 (2007).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).
- Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).
- Pivovarova, N. B., et al. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O’Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
- Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives. Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).
- Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro. Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).
- Brini, M., et al. Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation. The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).
- Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles. Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).
- Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).
- Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).
