Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.
Gevoeligheid voor neuron celdood geassocieerd met neurodegeneratie en ischemie zijn zeer toegenomen in de leeftijd van hersenen, maar mechanismen die verantwoordelijk zijn slecht bekend. Excitotoxiciteit een proces zou kunnen bijdragen aan zenuwbeschadiging veroorzaakt door zowel beledigingen wordt gemedieerd door activering van glutamaatreceptoren die Ca2 + influx en mitochondriale Ca2 + overload bevordert. Een belangrijke verandering in de intracellulaire Ca 2+ homeostase of verbouwen van de intracellulaire Ca 2+ homeostase kan neuron schade in het oude neuronen bevorderen. Voor het onderzoeken van Ca 2+ remodeling bij veroudering hebben we gebruik live cell imaging op lange termijn culturen van de rat hippocampus neuronen die lijken op sommige aspecten neuronen di vivo jaar. Voor dit doel, de hippocampus cellen, op de eerste plaats, vers verspreid van nieuwe zeepaardjes geboren rat en uitgeplaat op poli-D-lysine gecoat glas dekglaasjes. Daarna kweken worden in gecontroleerde media gedurende meerdere dagen of meerdere wEeks voor het onderzoeken van jong en oud neuronen, respectievelijk. Ten tweede worden gekweekte neuronen geladen met fura2 en onderworpen aan metingen van cytosolische Ca2 + -concentratie die digitale fluorescentieverhouding imaging. Ten derde worden gekweekte neuronen getransfecteerd met plasmiden die een tandem lage affiniteit aequorine en GFP gericht op mitochondria. Na 24 uur wordt aequorine in de cellen gereconstitueerd met coelenterazine en neuronen worden blootgesteld aan bioluminescentie beeldvorming voor monitoring van mitochondriale Ca2 + -concentratie. Dit drietrapsprocedure maakt het monitoren van cytosolische en mitochondriale Ca2 + responsen op stimuli zoals bijvoorbeeld de glutamaat receptor agonist NMDA wensen of deze en andere reacties worden beïnvloed door veroudering. Deze procedure kan nieuwe inzichten opleveren over hoe veroudering beïnvloeden cytosolische en mitochondriale Ca2 + respons op geselecteerde stimuli en het testen van de geselecteerde geneesmiddelen ter voorkoming neuronenceldood in leeftijd gerelateerde ziekten.
Excitotoxiciteit is een van de belangrijkste mechanismen die bijdragen aan neuronale schade en celdood in neurologische beledigingen zoals ischemie, en in sommige neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer 1. Dit type neurotoxiciteit wordt voornamelijk gemedieerd door glutamaat handelen over Ca 2+ -doorlaatbare, ionotrope NMDA-receptoren (NMDAR) 2. Blootstelling van gekweekte neuronen glutamaat excitotoxiciteit kan tot 3, waarbij neuronale apoptose 4 veroorzaakt. Wij en anderen hebben eerder gemeld dat neuronale gevoeligheid voor NMDA-geïnduceerde apoptose kan veranderen in vitro ontwikkeling en veroudering 5-8.
Het is algemeen aanvaard dat een toename van de vrije cytosolische Ca2 + -concentratie ([Ca2 +] cyt) leidt tot activatie cellen. Als dit echter aanleiding te hoog is en / of voldoende duurzame, kan celdood 9 leiden. Bovendien is voorgestelddat excitotoxiciteit vereist mitochondriale Ca2 + opname 10, aangezien het behandelen neuronen met een mitochondriale ontkoppelaar beschermd neuronen tegen door glutamaat geïnduceerde celdood 11. Indien mitochondriën te veel Ca2 +, kan de opening van de mitochondriale permeabiliteittransitieporie plaatsvinden, waardoor los van cytochroom C en andere pro-apoptotische factoren, en het induceren van apoptose. We hebben onlangs aangetoond dat mitochondriële Ca2 + opname direct gerelateerd aan de leeftijd afhankelijke gevoeligheid voor excitotoxiciteit, door direct meten van NMDA-geïnduceerde mitochondriale Ca2 + opname in enkele hippocampale neuronen 5, een werkwijze die is beschreven in dit artikel. De hippocampus, die betrokken zijn bij fysiologische processen zoals leren, geheugen en andere cognitieve processen 12, zeer gevoelig voor veroudering en neurodegeneratieve aandoeningen 13. Voorgesteld is dat, na een aantal weken in vitro gekweekthippocampale neuronen tonen een aantal typische kenmerken van oude neuronen 14. Dienovereenkomstig kan op lange termijn gekweekte hippocampale neuronen een alomvattend model Ca 2+ gemedieerde mechanismen van verbeterde excitotoxiciteit bij veroudering onderzoeken bieden.
Het algemene doel van de gepresenteerde methode is dan ook aanzienlijke veranderingen in intracellulaire Ca2 + homeostase of Ca2 + remodellering in de ouder wordende hersenen onderzoeken waaronder differentiële Ca2 + responsen opgewekt door NMDA receptor agonisten op lange-termijn gekweekte hippocampale neuronen . De werkwijze bevat een gedetailleerde beschrijving van de cultuur van rat hippocampale neuronen en de controle cytosolische en mitochondriale Ca2 + concentraties van fluorescentie en bioluminescentie beeldvorming in individuele neuronen, respectievelijk. Fluorescentiebeelvorming van cytosolisch Ca2 + in gekweekte neuronen is een standaardprocedure. Deze methode is minder betrouwbaar voor subcellulaire Ca2 + metingen zoals mitochondriale Ca2 +. Redenen hiervoor zijn onder andere het ontbreken van een goede afstemming van de synthetische probes en ongepast affiniteit voor Ca 2+ concentraties die kunnen veranderen in de mitochondriën van de lage uM niveau zelfs tot het mM niveau. Het gebruik van Ca2 + probes op basis van eiwitten zoals bijvoorbeeld aequorine, kon de targeting naar subcellulaire organellen en gebruik van derivaten verschillende Ca2 + affiniteiten met verschillende coelenterazines of gemuteerde probes ontbreekt specifieke Ca2 + bindingsplaatsen 15. Op deze wijze kan bioluminescentie beeldvorming van cellen die aequorine-mitochondriën gerichte monitoring van mitochondriale Ca2 + concentraties in individuele neuronen mogelijk te maken. Toch kan deze procedure het gebruik van fotontellende camera's of ultragevoelige CCD camera's voor bioluminescentie 16-18 vereist. Deze werkwijze kan nieuwe resultaten op die in meer establ worden bevestigdished hersenen veroudering modellen als, bijvoorbeeld, de hersenen plakjes van oude dieren.
De herinrichting van intracellulaire Ca2 + homeostase in het ouder wordende hersenen is gerelateerd aan cognitieve verliezen, verhoogde gevoeligheid voor ischemische schade, excitotoxiciteit en neurodegeneratie. Om deze hypothese in vitro onderzoeken, Ca 2+ beeldvormende procedures beschikbaar. Helaas, levensvatbare kweken van hippocampale neuronen oude niet betrouwbaar. Recentelijk is waargenomen dat langdurige culturen van de rat hippocampale neuronen onderhavige veel van de typische ken…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Ministerio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Leòn (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Brûlet (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.
Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
Gentamicin | Gibco | 15750 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
Papain | Worthington | LS003127 | |
4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
Digitonin | Sigma | D5628 | |
NMDA | Sigma | M3262 | |
Glycine | Sigma | 50046 | |
Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
Xcite ilumination system | EXFO | ||
ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |