マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
直流電界（DCEF）の下方向の細胞遊走の挙動は走電性と呼ばれます。胚発生の間の細胞移動、細胞分化、および創傷治癒を誘導する生理的DCEFの重要な役割が多くの研究で実証されています。走電性アッセイにマイクロ流体チップを適用することによって、調査プロセスが短縮され、実験誤差が最小化されます。近年では、マイクロ流体デバイスは、ポリマー物質（例えば、ポリメチルメタクリレート、PMMA又はアクリル）またはポリジメチルシロキサン（PDMS）が広く、電気刺激に対する細胞の応答を研究に使用されてきたから成ります。しかし、PDMSデバイスを製造するために必要な多数の工程とは異なり、uidicチップFLアクリルミクロの簡単かつ迅速な構築は、デバイスの試作と生産の両方に適しています。しかし、報告されたデバイスのいずれも、同時化学とDCEの効率的な研究を促進していません細胞上のFの影響。本稿では、私たちのデザインと肺癌細胞の化学的および電気刺激の同時効果を調査するアクリル系マルチチャンネルデュアル電界（MDF）チップの製造を説明します。 MDFチップは、単一のテストでは、電気的/化学的刺激の8の組み合わせを提供します。チップを大幅に必要な実験時間を短縮するだけでなく、走電性の研究の精度を向上させるだけではなく。
Introduction
直流電界（DCEF）の下で陽極または陰極に向かって移動し、接着細胞の挙動は、走電性と呼ばれます。細胞のelectrotactic挙動は、胚形成、神経再生、および創傷治癒において重要な役割を果たしている。そのようなラット前立腺癌細胞、2乳癌細胞、3および肺腺癌細胞を4-8として1腫瘍細胞を適用DCEF下electrotactic動きを示しています。生理学的EFは、腺組織において測定された。9,10走電性はまた、腺に関連する腫瘍細胞において報告されている。2,3まとめると、癌細胞の走電性は、転移因子であると考えられている。 図11は、電気的なガイダンスを制御しますDCEF下の癌細胞は、癌の将来の治療のための潜在的なアプローチであり得ます。しかし、今日、走電性の詳細な分子メカニズムは依然として議論の余地があります。したがって、INFの調査癌細胞遊走に対する電気刺激のluenceは、癌治療のための戦略の開発を容易にすることができます。
最近、バイオマイクロ流体デバイスは 、インビトロで、12化学勾配、13および電気刺激4にせん断力を流す細胞応答を研究するために作製されています。 （また、アクリル系として知られているPMMA）、ポリジメチルシロキサン（PDMS）またはポリメチルメタクリレートを使用して、バイオマイクロ流体デバイスの製造に成功し、そのような実験の失敗率が低下しています。さらに、生物学的対象を調査するためのプロトタイプとしてアクリル系のマイクロ流体デバイスを使用して、PDMSチップを使用するよりも簡単です。アクリルベースのデバイスで様々な機能が走電性研究のために開発されてきました。しかし、以前の設計のいずれも、同時に走電性研究のための細胞の種々の化学的条件や電界の影響をテストすることができません。したがって、我々は、マイクロ流体デバイスを開発したムーデュアル電界（MDF）チップ含有4つの独立した培養チャネルと1つのチップで8つの異なる実験条件をltichannel。
最初の侯らによって報告されたアクリル系MDFチップ、。、8は電気刺激し、いくつかの化学的に分離されたチャネルを統合しています。これらの化学的に単離されたチャネルは、1つの実験において培養する細胞の種類を使用することができます。チャンネル内DCEFは、電力供給によって生成されます。二つの独立した電場の印加電界強度（EFS）を有するものと0 EFSとは別の、それぞれの化学的に単離されたチャネルで行われます。このように、チップは、より良い制御の共存EFおよび化学的刺激を提供します。また、MDFチップ内部の化学拡散の数値シミュレーションの結果は、交差汚染は、24時間の実験期間の後にチャネル間で発生していないことを示している。8
デビと比較するとLiらによって報告されCE。、14 MDFチップを電気的に刺激された細胞のさらなる生化学的分析を可能にするより大きな培養面積を提供します。また、MDFチップの大きな観察領域に、より多くの細胞が、試験で観察することができるので、電気的に刺激された細胞の移動速度やdirectednessの分析はより正確です。 Huangらにより報告された以前の研究の単一チャネルチップ設計4、ツァイら 15細胞または化学物質の一種類のみを試験することを可能にします。ただし、MDFチップは走電性に様々な化学物質の影響、ならびに細胞の異なるタイプの電気刺激の効果を調査するために使用することができます。つまり、MDFチップは、化学線量依存性を効率的に研究することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、トリッキーなことをMDFチップのレイヤー1の上にアクリルアダプタを付着させる工程を発見しました。スーパー接着剤のわずか1〜2μLの適用はしっかりとMDFチップ上にアダプターを接着するのに十分です。接着剤より多量のは、スーパー接着剤と接着するための失敗の不完全な重合をもたらしました。アクリルアダプタがしっかりとMDFチップ上に付着させた後は、マイクロ流体シス?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
Riferimenti
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Hsu, W. -. C., Jhang, J. -. H., Young, T. -. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
