Podning af perler i at udvikle Chicken Embryo lemmer at identificere signaltransduktionsveje påvirker Gene Expression

Summary

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Abstract

Brug af kyllingefostre er det muligt direkte at afprøve virkningerne af enten vækstfaktorer eller specifikke inhibitorer af signalveje på genekspression og aktivering af signaltransduktionsveje. Denne teknik tillader levering af signalmolekyler på præcist definerede udviklingsstadier til bestemte tidspunkter. Herefter embryoner kan høstes og genekspression undersøges, for eksempel ved in situ hybridisering eller aktivering af signaltransduktionsveje observeret med immunfarvning.

I denne video heparin perler lægges i blød i FGF18 eller AG 1-X2 perler gennemvædet med U0126, en MEK-inhibitor, er podet ind i lem opløbet in ovo. Dette viser, at FGF18 inducerer ekspression af MyoD og ERK phosphorylering og både endogene og FGF18 induceret MyoD ekspression inhiberes af U0126. Perler gennemvædet i en retinsyre antagonist kan forstærke tidlig MyoD-induktion af FGF18.

Denne fremgangsmåde kan være osed med en lang række forskellige vækstfaktorer og inhibitorer og er let tilpasses til andre væv i udviklende embryo.

Introduction

Avian embryoner har givet et stærkt værktøj til undersøgelse af udviklingen i mange år ^1. En af deres mest nyttige egenskaber er, at de er relativt let at manipulere. Ekstern udvikling gør det muligt at åbne ægget at få adgang til embryo og udføre forskellige micromanipulations herunder eksempler som den klassiske vagtel-chick kimære system til at studere celle skæbne ^2,3, injektion af retrovirus til overekspression i specifikke væv under udviklingen ^4,5 og eksplantation kultur at identificere udviklingsmæssige signalsystemer kilder ^6. For nylig Kimærer frembringes mellem umærkede værter med transplantater fra en transgen kylling, der udtrykker GFP har vist, at kombinationen af klassisk podning og genmodificering kan give vigtig indsigt i udviklingen ^7,8.

Den lethed, hvormed den fugleembryo kan manipuleres har gjort det en fremragende model til undersøgelse af lemmerudvikling ^9. Anvendelse af specifikke vækstfaktorer til udviklingslandene lemmer in vivo har været medvirkende til at identificere faktorer, der ændrer lemmer mønsterdannelse ^10,11 og fortsætter med at give indsigt i denne proces ^12. Denne fremgangsmåde er også blevet anvendt til at undersøge de faktorer, der regulerer muskeludvikling og har afdækket roller for mange signaler, såsom Wnts ^13, BMP'er ^{14 og} HGF ^15.

For nylig denne teknik er blevet anvendt til at undersøge de signaler, der styrer myogene genekspression i knopskydninger og har vist, at interaktioner mellem FGF18 og retinsyre kan styre tidspunktet for MyoD ekspression ^16. Ved hjælp af en kombination af vækstfaktorer og små molekyler, der kan indlæses på perler og derefter podet direkte ind i specifikke væv på definerede udviklingsstadier giver mulighed for at gribe ind på næsten hvilket som helst tidspunkt og region under udvikling. Dette er blevet anvendt til INVEstigate mange processer, herunder somite mønsterdannelse ^17,18, neurale specifikation ^19, neuralkam migration ^{20 og} aksen forlængelse ^21.

Her beskriver vi en fremgangsmåde til podning perler gennemvædet i enten vækstfaktorer eller inhibitorer i at udvikle kylling lemmer. Det har været anvendt til at bestemme virkningerne af disse signaler på myogenese ved at analysere muskel specifik genekspression med in situ hybridisering. Vi beskriver transplantater enten via heparin gennemblødt perler, der anvendes til vækstfaktorer, eller AG 1-X2 perler til små hydrofobe molekyler, såsom retinsyre eller småmolekylære inhibitorer af specifikke signalveje. Men andre perler er også tilgængelige som er blevet anvendt til at levere både FGF'er ^{22 og} Shh ^23.

Protocol

Etik Statement: Alle disse eksperimenter følger dyret pleje og etiske retningslinjer fra University of Nottingham. 1. Fremstilling af heparin perler til podning Vask heparin perler grundigt i PBS før brug. Bemærk: Perlerne kan opbevares ved 4 ° C som en opslæmning i PBS. Vælg perler til podning ved at fjerne dem fra bestanden med en 20 gl pipette ind i en 1 ml dråbe PBS. Derefter bruge en mikropipette sat til 2 pi at overføre perler i et 20 pi dr?…

Representative Results

På HH trin 21 MyoD ikke udtrykkes i udviklingen lemmer myoblaster selv farvning kan ses i myotome af udviklingslandene somitter (figur 1A). Figur 1B viser in situ-hybridisering for MyoD 6 timer efter en FGF18 perle graft. MyoD induceres i myoblaster tæt på perlen mens der er ingen ekspression i kontralaterale ben. Co-podning en vulst dyppet i U0126, en specifik inhibitor af MEK, blokke FGF18 induktion af MyoD (figur 1C). Tilsvarende podning en U0126 perle p?…

Discussion

Brugen af ​​perle transplantater anvendes direkte til at udvikle væv in ovo er et kraftfuldt værktøj til at dissekere rolle vækstfaktor signalering under udviklingen giver uovertruffen kontrol over udviklingsstadiet, hvor de anvendes, og varigheden af ​​eksponeringen.

Valget af perle for hver type molekyle er vigtig. Små hydrofobe molekyler, såsom de her beskrevne inhibitorer og retinsyre, normalt binder godt til derivatiseret AG 1-X2 perler selv om det er nødvendigt at teste …

Materials

Heparin acrylic beads	Sigma	H5263	The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blue beads	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126	Cell Signalling	9903	Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink	Windsor and Newton	5012572003384 (30ml)	While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%	Alfa Aesar	10404
Penicillin / streptomycin	Sigma	P0781	Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS