Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression
Summary
By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.
Abstract
Mit Hühnerembryonen es möglich ist, zur direkten Prüfung der Wirkung von entweder Wachstumsfaktoren oder spezifische Inhibitoren von Signalwegen auf die Gen-Expression und Aktivierung von Signaltransduktionswegen. Diese Technik ermöglicht die Abgabe von Signalmolekülen an genau definierten Entwicklungsstadien für bestimmte Zeiten. Nach dieser Embryonen können geerntet werden und Genexpression untersucht, beispielsweise durch in situ Hybridisierung oder Aktivierung des Signals mit der Immunfärbung beobachtet Übertragungswegen.
In diesem Video-Heparin-Perlen in FGF18 getränkt oder AG 1-X2 Perlen in U0126, ein MEK-Inhibitor eingeweicht, in die Gliedmaßenknospe in ovo gepfropft. Dies zeigt, dass FGF18 induziert die Expression von MyoD und ERK Phosphorylierung und sowohl endogene als auch FGF18 induziert MyoD Expression durch U0126 gehemmt. Perlen in einer Retinsäure Antagonisten getränkt können vorzeitige MyoD Induktion durch FGF18 potenzieren.
Dieser Ansatz kann unsed mit einer Vielzahl von verschiedenen Wachstumsfaktoren und Inhibitoren und wird leicht auf andere Gewebe in den sich entwickelnden Embryo angepasst.
Introduction
Vogelembryonen haben ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Entwicklung seit vielen Jahren 1 vorgesehen. Eines ihrer nützlichen Eigenschaften ist, dass sie relativ einfach zu manipulieren sind. Externe Entwicklung macht es möglich, das Ei zu öffnen, um den Embryo zugreifen und verschiedene Mikromanipulationen mit Beispielen wie dem klassischen Wachtel-Küken Chimärensystem zur Untersuchung des Zellschicksals 2,3, die Injektion von Retroviren für die Überexpression in bestimmten Geweben während der Entwicklung 4,5 und Explantatkultur entwicklungsSignalQuellen 6 zu identifizieren. Jüngerer Chimären zwischen unmarkiertem Hosts mit Transplantaten von einem transgenen Huhn Linie, die GFP generiert hat gezeigt, dass die Kombination von klassischen Pfropfen und genetische Modifikation kann wichtige Einsichten in die Entwicklung 7,8 bereitzustellen.
Die Leichtigkeit, mit der der Vogelembryo kann manipuliert werden, ist es ein hervorragendes Modell für die Untersuchung des Körpers gemachtEntwicklungs 9. Anwendung spezifischer Wachstumsfaktoren auf die Entwicklung Gliedmaßen in vivo war maßgeblich an der Identifizierung von Faktoren, die Gliedmaßen Musterung 10,11 verändern und weiterhin Einblicke in diesen Prozess 12 bereitzustellen. Dieser Ansatz ist auch verwendet worden, um die Faktoren, die die Entwicklung der Muskulatur regulieren zu studieren und hat Rollen für zahlreiche Signale wie Wnts 13, 14 und BMPs HGF 15 freigelegt.
Kürzlich wurde diese Technik verwendet, um die Signale, die myogene Genexpression in der Extremitätenknospe untersuchen und zu zeigen, dass Interaktionen zwischen FGF18 und Retinsäure kann das Timing MyoD Expression 16 zu steuern. Mit einer Kombination von Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle, die auf Kügelchen geladen werden kann und dann direkt in spezifischen Geweben in bestimmten Entwicklungsstadien gepfropft die Möglichkeit gibt, zu fast jeder Zeit und Region bei der Entwicklung einzugreifen. Dies wurde verwendet, um INVEstigate viele Prozesse einschließlich Somiten Musterung 17,18, neuronale Spezifikation 19, Neuralleiste Migration 20 und Achse Verlängerung 21.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Pfropfen von Kügelchen in entweder Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren in der Entwicklung Hühnerschenkel eingeweicht. Dies kann genutzt werden, um die Auswirkungen dieser Signale auf myogenesis durch Analysieren muskelspezifische Genexpression in situ-Hybridisierung zu bestimmen. Wir beschreiben Transplantate unter Verwendung von entweder Heparin getränkten Kügelchen, die für Wachstumsfaktoren oder AG 1-X2 Perlen für kleine hydrophobe Moleküle, wie Retinsäure oder Kleinmolekül-Inhibitoren spezifischer Signalwege verwendet. Aber auch andere Perlen sind ebenfalls verfügbar, die verwendet wurden, um sowohl FGFs und Shh 23 22 zu liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von Transplantaten Wulst unmittelbar entwickelnden Geweben in ovo angelegt ist ein mächtiges Werkzeug, um die Rolle von Wachstumsfaktor-Signalweges während der Entwicklung geben beispiellose Kontrolle über die Entwicklungsstufe, bei der sie angewendet werden, und die Dauer der Exposition zu sezieren.
Die Wahl der Wulst für jede Art von Molekülen ist wichtig. Kleinen hydrophoben Molekülen, wie den hier beschriebenen Inhibitoren und Retinsäure, normalerweise gut binden de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.
Materials
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
Riferimenti
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Bell, E., Brickell, P. Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo. Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).
- Abu-Elmagd, M., et al. Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis. Biologia dello sviluppo. 337, 211-219 (2010).
- Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. Development. 121, 651-660 (1995).
- McGrew, M. J., et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).
- Valasek, P., et al. Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle. Biologia dello sviluppo. 357, 108-116 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Rosello-Diez, A., Torres, M. Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells. Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).
- Anakwe, K., et al. Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing. Development. 130, 3503-3514 (2003).
- Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. The importance of timing differentiation during limb muscle development. Current Biology. 8, 642-652 (1998).
- Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo. Biologia dello sviluppo. 179, 303-308 (1996).
- Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts. Biologia dello sviluppo. 396, 214-223 (2014).
- Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5. Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).
- Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals. Development. 127, 4105-4113 (2000).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Martinez-Morales, P. L., et al. FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).
- Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension. Development. 134, 2125-2135 (2007).
- Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity. Development. 125, 2825-2835 (1998).
- Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes. Development. 125, 777-790 (1998).
- Sweetman, D., et al. FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos. Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).
- Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals. BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).
- Scott, B. B., Lois, C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).
- Seidl, A. H., et al. Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).
