जीन एक्सप्रेशन से पीडि़त संकेत पारगमन रास्ते की पहचान करने के लिए चिकन भ्रूण अंग विकसित करने में मोतियों की ग्राफ्टिंग
Summary
By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.
Abstract
चिकन भ्रूण का उपयोग यह सीधे वृद्धि कारक या जीन अभिव्यक्ति और संकेत पारगमन मार्ग की सक्रियता पर संकेत दे रास्ते के विशिष्ट अवरोधकों या तो के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए संभव है। इस तकनीक को विशेष समय के लिए ठीक से परिभाषित विकास के चरणों में संकेतन अणुओं की डिलीवरी की अनुमति देता है। इस भ्रूण काटा और जीन अभिव्यक्ति स्वस्थानी संकरण, या immunostaining के साथ मनाया संकेत पारगमन मार्ग के सक्रियण में, उदाहरण के लिए जांच की जा सकती हैं।
U0126, एक खल्क अवरोध करनेवाला में भिगो इस FGF18 में भिगो वीडियो हेपरिन मोती या एजी 1-X2 के मोतियों की माला में, ओवो में अंग कली में grafted रहे हैं। इस FGF18 U0126 से हिचकते हैं Myod और ERK फास्फोरिलीकरण और अंतर्जात और FGF18 प्रेरित दोनों Myod अभिव्यक्ति की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है कि पता चलता है। एक retinoic एसिड प्रतिपक्षी में भिगो मोती FGF18 द्वारा समय से पहले Myod प्रेरण शक्ति प्रदान कर सकते हैं।
यह दृष्टिकोण हमें हो सकता हैविभिन्न विकास कारकों और अवरोधकों और की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एड आसानी से विकासशील भ्रूण में अन्य ऊतकों के लिए अनुकूल है।
Introduction
एवियन भ्रूण कई वर्षों से एक के लिए विकास के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान की है। उनके सबसे उपयोगी विशेषताओं में से एक है कि वे हेरफेर करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं। बाहरी विकास के इस तरह के सेल भाग्य 2,3 के अध्ययन के लिए क्लासिक बटेर-लड़की कल्पना प्रणाली के रूप में उदाहरण सहित विभिन्न micromanipulations भ्रूण का उपयोग करने में अंडे का खोल सकते हैं और प्रदर्शन करने के लिए यह संभव बनाता है, विकास 4,5 के दौरान विशिष्ट ऊतकों में overexpression के लिए रेट्रोवायरस के इंजेक्शन और explant संस्कृति विकास संकेतन स्रोतों 6 की पहचान करने के लिए। अभी हाल ही में GFP व्यक्त एक ट्रांसजेनिक चिकन लाइन से ग्राफ्ट के साथ लेबल हटाया मेजबान के बीच उत्पन्न काइमेरा शास्त्रीय ग्राफ्टिंग और आनुवंशिक संशोधन के संयोजन विकास 7.8 में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि दिखाया गया है।
एवियन भ्रूण हेरफेर किया जा सकता है जिस आसानी अंग के अध्ययन के लिए यह एक शानदार मॉडल बना दिया हैविकास 9। विवो में विकासशील अंगों के लिए विशिष्ट वृद्धि कारकों के आवेदन अंग patterning 10,11 में परिवर्तन और इस प्रक्रिया को 12 में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी है कि कारकों की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। यह दृष्टिकोण भी मांसपेशियों के विकास को नियंत्रित करने वाले कारकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और इस तरह के Wnts 13, BMPs 14 और HGF 15 के रूप में कई संकेतों के लिए भूमिकाओं का पर्दाफाश किया है।
हाल ही में इस तकनीक का अंग कली में myogenic जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के संकेतों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और FGF18 और retinoic एसिड के बीच बातचीत Myod अभिव्यक्ति 16 के समय को नियंत्रित कर सकते हैं कि दिखाया गया है। मोती पर लादा और फिर परिभाषित विकास के चरणों में विशिष्ट ऊतकों में सीधे grafted जा सकता है कि विकास कारकों और छोटे अणुओं का एक संयोजन का उपयोग विकास के दौरान लगभग किसी भी समय है और इस क्षेत्र में हस्तक्षेप करने का अवसर देता है। इस inve करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैविखंड patterning 17,18, तंत्रिका विनिर्देश 19, तंत्रिका शिखा पलायन 20 और एक्सिस विस्तार 21 सहित कई प्रक्रियाओं stigate।
यहाँ हम चिकन अंगों के विकास में या तो वृद्धि कारक या अवरोधकों में भिगो मोतियों ग्राफ्टिंग के लिए एक विधि का वर्णन है। इस स्वस्थानी संकरण में साथ मांसपेशियों विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके myogenesis पर इन संकेतों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम इस तरह के retinoic एसिड या विशिष्ट संकेत दे रास्ते के छोटे अणु अवरोधकों के रूप में छोटे हाइड्रोफोबिक अणुओं के लिए वृद्धि कारक है, या एजी 1-X2 मोती के लिए उपयोग किया जाता है जो हेपरिन लथपथ मोती, या तो उपयोग ग्राफ्ट का वर्णन है। हालांकि अन्य मोती भी FGFs 22 और श्श्श 23 दोनों वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जो उपलब्ध हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
ओवो में ऊतकों को विकसित करने के लिए सीधे आवेदन मनका ग्राफ्ट का उपयोग वे लागू कर रहे हैं, जिस पर विकास मंच और जोखिम की अवधि से अधिक अद्वितीय नियंत्रण दे रही है विकास के दौरान वृद्धि कारक सिगनल की भूमिका क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.
Materials
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
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