L'innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l'espressione genica

Sommario

Innestando perline imbevute di fattori di crescita o inibitori specifici delle vie di segnalazione negli embrioni in via di sviluppo, è possibile testare direttamente i loro effetti in vivo. In questo protocollo, le perle vengono innestate nella gemma dell'arto per determinare gli effetti di queste molecole sull'espressione genica e sulla trasduzione del segnale.

Abstract

Usando embrioni di pollo è possibile testare direttamente gli effetti delle due fattori di crescita o inibitori specifici di vie di segnalazione di espressione genica e attivazione di vie di trasduzione del segnale. Questa tecnica permette la consegna di molecole di segnalazione in stadi di sviluppo ben definiti per i tempi specifici. Dopo questo embrioni possono essere raccolte e l'espressione genica esaminati, ad esempio in situ ibridazione, o l'attivazione di vie di trasduzione del segnale osservato con immunocolorazione.

In questo video di eparina perline imbevuti di FGF18 o AG perline 1-X2 imbevute di U0126, un inibitore di MEK, si innestano nel bocciolo arto in ovo. Questo dimostra che FGF18 induce l'espressione di MyoD e ERK fosforilazione e espressione MyoD sia endogena e FGF18 indotta è inibito dalla U0126. Perline imbevuto di un antagonista dell'acido retinoico possono potenziare l'induzione prematura MyoD da FGF18.

Questo approccio può essere noied una vasta gamma di fattori di crescita e inibitori e si adatta facilmente ad altri tessuti embrioni.

Introduzione

Embrioni aviaria hanno fornito un potente strumento per lo studio di sviluppo per molti anni ^1. Una delle loro caratteristiche più utili è che sono relativamente facili da manipolare. Sviluppo esterno consente di aprire l'uovo per accedere l'embrione ed eseguire varie micromanipolazioni con esempi come il sistema chimera quaglia-chick classico per lo studio il destino della cellula ^2,3, l'iniezione di retrovirus per sovraespressione in tessuti specifici durante lo sviluppo ^4,5 e la cultura espianto di identificare le fonti di segnalazione di sviluppo ^6. Più recentemente chimere generato tra gli host non etichett....

Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e le linee guida etiche del l'Università di Nottingham.

1. Preparazione di Beads eparina per innesto

1. Lavare accuratamente perle di eparina in PBS prima dell'uso. Nota: Beads possono essere conservati a 4 ° C come una sospensione in PBS.
   1. Selezionare perline per innesto rimuovendoli dal magazzino con una pipetta 20 microlitri in una goccia 1 ml di PBS. Quindi utilizzare una micropipetta set a 2 ml di trasferire perle in un calo del 20 microlitri di PBS in una capsula di Petri 3 centimetri. Scegli perline in base alle dime....

Risultati

Nella fase HH 21 MyoD non è espresso in mioblasti sviluppo arto sebbene colorazione può essere visto in myotome dei somiti sviluppo (Figura 1A). Figura 1B mostra ibridazione in situ per MyoD 6 ore dopo un innesto FGF18 tallone. MyoD è indotta in mioblasti vicino al tallone, mentre non vi è alcuna espressione nell'arto controlaterale. Co-innestando un branello imbevuto U0126, un inibitore specifico di MEK, induzione blocchi FGF18 di MyoD (Figura 1C). Allo st.......

Discussione

L'utilizzo di innesti tallone applicati direttamente allo sviluppo di tessuti in ovo è un potente strumento per analizzare il ruolo del fattore di crescita di segnalazione durante lo sviluppo dando il controllo senza precedenti sopra lo stadio di sviluppo in cui vengono applicate e la durata dell'esposizione.

La scelta del cordone per ogni tipo di molecola è importante. Piccole molecole idrofobe, come gli inibitori qui descritte ed acido retinoico, di solito si legano bene al derivat.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Perle acriliche di eparina	Sigma	H5263	Le perle acriliche-epariche utilizzate sono state interrotte. Tuttavia è disponibile un prodotto sostitutivo, perline di agarosio eparina, gatto n. H6508. Questi sono trasparenti, quindi più difficili da lavorare, ma possono essere macchiati con rosso fenolo allo stesso modo delle perle AG 1-X2,
perline AG 1-X2	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel perline blu	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	Queste perle sono state utilizzate con una gamma di fattori di crescita tra cui Shh e FGF e possono essere utilizzate per sostituire le perle di eparina
FGF18	Peprotech	100-28	Risospendere in PBS con 0/1% di BSA, preparare aliquote monouso da 0,5-1ul e conservare a -80°C. I lotti e i fornitori possono variare, quindi è necessario testare concentrazioni diverse per determinare una dose efficace.
U0126	Segnalazione cellulare	9903	Produrre a 20mM in DMSO e conservare in aliquote monouso a -80 °C. Proteggere dalla luce.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Risospendere in DMSO e conservare in aliquote monouso a -80 °C. Proteggere dalla luce.
Inchiostro di china nero	Windsor e Newton	5012572003384 (30 ml)	Sebbene siano disponibili alternative a questo prodotto, è necessario prestare attenzione poiché alcuni inchiostri sono tossici per gli embrioni
Filo di tungsteno, diametro 0,1 mm 99,95%	Alfa Aesar	10404
Penicillina / streptomicina	Sigma	P0781	Diluire 100X in PBS/inchiostro e PBS/FCS