By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.
Ved hjelp av kyllingembryoer er det mulig å teste direkte effektene av enten vekstfaktorer eller spesifikke inhibitorer av signalveier på genekspresjon og aktivering av signaloverføringsreaksjonsveier. Denne teknikken gjør at levering av signalmolekyler på presist definerte utviklingsstadier for bestemte tider. Etter dette embryo kan høstes og genekspresjon undersøkes, for eksempel ved in situ hybridisering, eller aktivering av signaltransduksjonsveiene observert med immunfarging.
I videoen heparin perler dynket i FGF18 eller AG 1-X2 perler dynket i U0126, en MEK inhibitor, er podet inn i lem knopp i ovo. Dette viser at FGF18 induserer uttrykk for myod og ERK-fosforylering og både endogene og FGF18 indusert myod uttrykk hemmes av U0126. Perler dynket i en retinsyre antagonist kan potensere tidlig myod induksjon av FGF18.
Denne tilnærmingen kan være ossed med et bredt spekter av forskjellige vekstfaktorer og inhibitorer og kan lett tilpasses andre vev i utvikling av embryo.
Avian embryo har gitt et kraftig verktøy for å studere utvikling i mange år 1. En av de mest nyttige egenskaper er at de er forholdsvis lette å manipulere. Ekstern utvikling gjør det mulig å åpne egget å få tilgang til embryoet og utføre forskjellige micromanipulations inkludert eksempler som klassiske vaktel-chick kimær system for å studere celle skjebne 2,3, injeksjon av retrovirus for overekspresjon i bestemte vev under utvikling 4,5 og eksplantering kultur for å identifisere utviklingssignalkilder 6. Flere nylig kimeras generert mellom umerkede vertene med grafts fra en transgen kylling linje som uttrykker GFP har vist at kombinasjonen av klassisk pode og genmodifisering kan gi viktig innsikt i utviklingen 7,8.
Den enkle som avian embryo kan manipuleres har gjort det en utmerket modell for å studere lemutvikling 9. Bruk av spesifikke vekstfaktorer for å utvikle lemmer in vivo har vært medvirkende i å identifisere faktorer som endrer lem mønster 10,11 og fortsetter å gi innsikt i denne prosessen 12. Denne fremgangsmåten har også blitt brukt til å studere de faktorer som regulerer muskelutvikling og har avdekket roller for en rekke signaler som Wnts 13, BMP 14 og 15 HGF.
Nylig denne teknikken har blitt brukt til å undersøke de signalene som styrer myogenic genuttrykk i lem knopp og har vist at interaksjoner mellom FGF18 og retinsyre kan kontrollere tidspunktet for myod uttrykk 16. Ved hjelp av en kombinasjon av vekstfaktorer og små molekyler som kan legges på perler og deretter podet direkte inn i bestemte vev på definerte utviklingsstadier gir mulighet til å gripe inn på nesten enhver tid og region under utvikling. Dette har blitt brukt til å investigate mange prosesser inkludert somitt mønster 17,18, nevrale spesifikasjon 19, neural crest migrasjon 20 og aksen forlengelse 21.
Her beskriver vi en metode for pode perler dynket i enten vekstfaktorer eller hemmere til å utvikle kylling lemmer. Dette har blitt benyttet for å bestemme effekten av disse signaler på myogenese ved å analysere muskel spesifikk genekspresjon med di situ-hybridisering. Vi beskriver grafts ved å bruke enten heparin fuktet perler, som brukes for vekstfaktorer, eller AG 1-X2-perler for små hydrofobe molekyler, slik som retinsyre eller lavmolekylære inhibitorer av spesifikke signalveier. Men andre perler er også tilgjengelige som har blitt brukt til å levere både FGF 22 og Shh 23.
Bruken av perle grafts brukes direkte til å utvikle vev i ovo er et kraftig verktøy for å dissekere rollen som vekstfaktor signale under utvikling som gir enestående kontroll over utviklingsstadiet hvor de brukes og varigheten av eksponeringen.
Valget av vulsten for hver type molekyl er viktig. Små hydrofobe molekyler, slik som de inhibitorene som beskrives her og retinsyre, vanligvis bindes godt til derivatisert AG 1-X2-perler, selv om det er nødvendig å teste effektiviteten av hver …
The authors have nothing to disclose.
This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.
Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |