Mécano-profilage facile et précis sur Micropost Arrays

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

Tests cellulaires mécano-sensibles permettent d'enquêter sur les cellules adhérentes, avec une large gamme d'applications qui reflètent le rôle central que peuvent jouer la mécanique en biologie cellulaire. Ces applications se concentrent souvent sur les mécanismes sous-jacents qui animent les processus intracellulaires ou le comportement de cellules entières. D'une part, les facteurs externes environnementaux tels que la composition de la matrice extra-cellulaire ou la rigidité de la matrice peuvent considérablement influer sur la réponse mécanique et biologique d'une cellule. ¹ La même chose peut être observée après utilisation de plusieurs classes de composés pharmaceutiques actifs, dont les effets sont caractérisé souvent en utilisant des modèles de culture de cellules. ^{2 Dans} les autres propriétés génotypiques à main, tels que ceux causés par des mutations génétiques spontanées ou induites expérimentalement, peut induire des changements marqués dans le phénotype des cellules qui sont associées à des altérations de la structure et la fonction du cytosquelette. ³ Ces exemples sont quelques-uns des nombreux possiblesujets pour lesquels phénotypage mécanique des cellules est pertinente, et tous ceux-ci ont été utilement étudiée avec des tableaux de Micropost.

Au moment d'écrire ces lignes, environ 200 articles ont été publiés décrivant l'interaction cellule-micropost. Ces œuvres de discuter des aspects théoriques de Micropost principes de déviation ainsi que des instructions pratiques sur leur fabrication. Le premier article décrivant l'interaction des cellules et des tableaux de Micropost flexibles a été publié par Tan et ses collègues en 2003. ⁴ Contrairement à la microscopie à force de traction classique (TFM) où substrats souples continues sont utilisées pour estimer la contractilité cellulaire nanonewton échelle, Tan et al. décrit une méthode utilisant des faisceaux multiples verticales rapprochées en élastomère silicone. Les principaux avantages de cette technique se dégagent de deux caractéristiques principales. D'abord afin de modifier la rigidité du substrat cellulaire apparente il suffit de modifier les dimensions de Micropost tout en gardantla composition du substrat par ailleurs constante et en évitant ainsi les différences de topologie de surface et la chimie. Deuxième microposts agissent comme des ressorts individuels qui peuvent être analysés discrètement avec force et résolution spatiale de l'ordre des adhésions focales individuels et peut réduire les défis analytiques qui sont inhérents à l'analyse analogue par la norme TFM.

Aujourd'hui, la gamme d'applications pour les réseaux de Micropost dépasse grandement simplement la cartographie des forces pendant quelques cellules individuelles. Par exemple, Akiyama rapporte l'utilisation d'un tissu de vaisseau dorsal isolé à partir d'une chenille de papillon comme un actionneur destiné à un réseau de micro-message, afin de développer un robot autonome micro-propulsion musculaire insecte. ⁵

Cependant, la plupart des applications publiées de microposts ont mis l'accent sur les études de conditions médicales telles que l'infection ou un cancer. Par exemple, les tableaux de Micropost ont été utilisés pour étudier la production d'groupé pili de type IV de Neisseria gonorrh de forceoea colonies qui est associé à l'amélioration de cascades de signaux infection. ⁶ D'autres ont utilisé microposts pour étudier les cellules de cancer du sein traitées avec des composés pharmaceutiques ciblant le cytosquelette. ⁷

Déviation d'un micro-message est souvent décrit en utilisant la théorie de faisceau classique pour une console avec une charge d'extrémité en supposant que la cellule attache seulement à la pointe de la micropost. Ici, la force F appliquée qui provoque une déviation δ dépend de "rigidité de flexion" S k et le micro-message est calculée par:

(1)

avec E, I et L étant le module de Young, le moment d'inertie de la zone et de la poutre longueur respectivement. Cependant, les résultats de cette équation ne donnent qu'une approximation générale des forces à l'œuvre depuis le cisaillement de la poutre et de flexion ainsi que la déformation du substrat ne sont pas prises en courant alternatifcompter. Considérant que microposts sont généralement fabriqués à partir de matériaux souples comme le polydiméthylsiloxane (PDMS) à base de caoutchouc de silicone de ces facteurs doivent être inclus. . Schoen et al a montré qu'il existe un tel facteur de correction en se basant sur ​​le rapport d'aspect du micro-message (L / D) et du polymère correspondant coefficient de Poisson v ⁸ Il est donné par.:

(2)

Avec _T Tilt (v) étant un coefficient de basculement qui comprend un raccord paramètre = 1.3 que l'on peut trouver dans le même article:

(3)

Cela signifie que la rigidité d'un micropost corrigée k _corr est le produit de la rigidité à la flexion pur k = k _{virage et} le facteur de correction corrdonné par:

(4)

Par conséquent, les calculs de la force de cellules devraient être effectuées en utilisant la variation plus raffinée de l'équation (1) en train de lire:

(5)

L'impact de la correction devient plus évident dès que les valeurs typiques pour les dimensions de Micropost sont utilisés. Par exemple, une longue micro-message 15 microns avec une section transversale circulaire et un diamètre de 5 um en caoutchouc de silicone à base de PDMS conduit à un facteur de correction de 0,77 et donc un calcul non corrigé serait surestimer les forces de cellules exercée par 23%. Cela devient encore plus sévère pour les micro-messages avec des rapports d'aspect plus petits.

Traditionnellement, micropost analyse d'image a également été basée sur la théorie de flexion du faisceau idéalisée. En 2005, le groupe qui a lancé l'utilisation de MICRtableaux de opost publié un logiciel d'analyse d'image adaptée à l'analyse de micropost ⁹ Le logiciel requiert une licence de logiciel et l'utilisateur doit prendre trois images pour chaque position. une chacune de plans supérieur et inférieur de la micro-message en mode de transmission et une autre en mode de fluorescence avec la cellule colorée. Après avoir comparé les positions supérieure et inférieure pour chaque Micropost le logiciel détermine un champ force de vecteur et calcule les paramètres connexes comme force par poste. Les autres logiciels existent et leurs principes de l'analyse sont brièvement mentionnés dans les articles correspondants qui les décrivent, mais ces progiciels d'analyse sont généralement pas accessibles au public. ^10,11

Les tableaux de Micropost conçus pour les forces de cellules de cartographie peuvent être classés comme étant dans une mise en micropost orthogonale ou un être hexagonale, dont le dernier qui ont l'avantage de lacunes équidistants entre tous microposts voisins. Microposts typiques have une section transversale circulaire et vont de 1,0 um à 10 um de diamètre et de 2 à 50 mm de longueur. ⁴ leurs dimensions Cependant, microposts avec section elliptique ou carrée ont également été signalés. ^12,13

L'utilisation de mélanges de silicones à base de PDMS comme matière de micro-message pour l'ajout de nanoparticules permet dans le mélange. Par exemple en ajoutant cobalt nano-barres permet une activation magnétique de la micropost et donne ainsi un autre degré de liberté de modèles expérimentaux potentiels. ¹⁴ La plupart des groupes produisent leurs réseaux de Micropost sur ​​des substrats rigides plats comme le verre de couverture ou à l'intérieur d'une boîte de Petri. Cependant, Mann et ses collègues ont récemment rapporté une matrice de micro-message formé sur une membrane extensible. ¹⁵ Cela permet à l'application de l'étirement cellulaires forces de cellules adhérentes tout en étudiant cellules vivantes subcellulaire réponses dynamiques en termes de la contractilité cellulaire.

L'éta et le plus largement utiliséblies processus pour la fabrication de tableaux de Micropost est basé sur la lithographie douce comme décrit dans les protocoles perspicaces de Sniadecki et collègues. ^16-18 Dans courtes processus de salle blanche standard sont utilisés pour générer les microstructures sur le dessus d'une plaquette de silicium en utilisant résine photosensible SU8. Ceci est suivi par un processus de copie, dans lequel le caoutchouc silicone est moulée sur les structures les transférer dans les moules. Dans une deuxième étape ces moules sont utilisés pour reproduire la microstructure initiale en utilisant un caoutchouc de silicone sur le dessus d'un substrat choisi. Cependant, malgré le nombre important et croissant de publications liées à leur application, en établissant un processus de fabrication pour microposts prend beaucoup de temps, même pour des experts micro-ingénierie; il existe de nombreuses étapes de traitement qui nécessitent une optimisation et l'adaptation à l'environnement de laboratoire micro-message spécifique et la mise en page pour obtenir un niveau de qualité acceptable.

Tableaux de Micropost commerciales sont maintenant disponibles dans un prête-to-utilisation ("off-the-shelf») format avec un qualité constante. Comme tels, ils sont une alternative à la longue et complexe processus de fabrication nécessaires à la production sur place. Dans cet article, un tableau de micropost disponible dans le commerce a été utilisé pour cartographier les forces cellulaires en utilisant une seule image à champ lumineux microscopie. Plus important encore cet article décrit et documente un logiciel open-source entièrement fonctionnelle nommé MechProfiler, qui est disponible en téléchargement en tant que matière supplémentaire à ce manuscrit. Une version maintenue activement du logiciel peut également être trouvé à http://www.orthobiomech.ethz.ch.

La combinaison d'un essai "off-the-shelf» et un logiciel d'analyse compatible open-source abaisse nettement l'entrée obstacle pour atteindre expériences précises TFM. Chercheurs sans accès ni salles blanches ou des logiciels expertise en développement peuvent analyser les forces cellulaires succès. Il permet à un utilisateur de se concentrer sur les mechanossortie de dosage de ensitivity plutôt que la technologie elle-même, et qui rend la mesure de la force de traction disponible à une communauté plus large. En outre, cela est une étape importante pour ouvrir la voie vers le dépistage entièrement automatique de tableaux de Micropost.

Le logiciel d'analyse MechProfiler traite les images en format de fichier tiff, png, bmp et jpg. Les images peuvent être prises en utilisant la fluorescence, contraste de phase ou de la microscopie optique à champ lumineux. Le programme autonome fonctionne conjointement avec la libre MATLAB Compiler Runtime (disponible à l'adresse: Figure 12) et algorithmes sous-jacents de permettre le traitement d'image simplifiée, qui permet à l'utilisateur de traiter des images avec des cellules uniques ou multiples dans environ 1 min. En outre, ces cellules peuvent être soit vivant ou «fixes».

Le logiciel MechProfiler est capable d'augmenter grandement l'analyse de données débit en se fondant sur la reproductibilité de réseaux de Micropost commerciale de qualité, plus spécifiquement, la valeur par défaut & #8220; non dévié "position de chaque poste dans le tableau peut être présumé contre une grille idéale (les écarts de fabrication de la grille dans les tableaux utilisés pour cette étude étaient inférieures à 100 nm).

En bref on ouvre une sélection de fichiers d'image pour l'analyse, les cultures de la région d'intérêt, définit les postes couverts par des cellules ou qui doivent être mis au rebut, détermine les positions de départ, calcule les déviations / forces contre la grille idéale, et enfin enregistre toutes les données spécifiques des cellules avec une possibilité pour l'exportation, y compris à une feuille de calcul de bureau standard.

Protocol

1. la culture de cellules sur Micropost Arrays Remarque: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour assurer la stérilité. Les volumes sont indiquées ici pour des flacons de culture T25 cellulaire. La densité de la recette et ensemencement cellulaire milieu de culture cellulaire sont optimisés pour les lignées cellulaires de cancer de l'os HuO9 et M132. Préparer une culture de cellules pour l'ensemencement sur un rés…

Representative Results

Le principal avantage de la technique décrite réside dans sa simplicité et le potentiel pour une intégration rapide et efficace dans le travail de laboratoire de routine. La combinaison des réseaux de capteurs commerciaux de haute qualité jumelés avec des logiciels open-source fournit des informations sur la mécano-sensibilité qui autrement nécessite l'accès à des installations de salles blanches et d'une connaissance approfondie de l'analyse de l'image et le développement de logiciels. <str…

Discussion

Ce travail vise à faire progresser le domaine de la force de traction microscopie en abaissant considérablement les obstacles techniques et pratiques à l'entrée. Ces obstacles proviennent de deux côtés. Tout d'abord sont les nombreux défis techniques non négligeables qui doivent être surmontés pour la fabrication reproductible et mettre en service un réseau de micropost expérimentalement. Deuxièmement, la nécessité est de même non négligeable pour une analyse semi-automatique fiable des forces d…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera