Micropost 배열에 쉽고 정확한 - 기계 프로파일

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

– 기계에 민감한 세포 기반 분석은 역학 세포 생물학에서 재생할 수있는 중심적인 역할을 반영하는 다양한 애플리케이션으로, 부착 세포를 조사 할 수 있습니다. 이 애플리케이션은 세포 내 프로세스 또는 전체 셀 동작을 구동하는 기본 메커니즘에 초점을 맞추고있다. 한편, 예컨대 세포 외 매트릭스 조성물 또는 매트릭스 강성 같은 외부 환경 요인 극적 셀의 기계적 및 생물학적 반응에 영향을 미칠 수있다. ⁽¹⁾ 같은 약학 적 활성 화합물의 많은 클래스의 사용 후에 관측 될 수 있고, 효과가있는 아르 종종 세포 배양 모델을 이용하여 특징으로한다. ⁽²⁾ 등의 골격 구조 및 기능의 변화와 관련된 세포 표현형으로 표시 변경을 유도 할 수 자발 또는 실험적으로 유도 된 유전자 돌연변이에 의한 것과 같은 다른 한편 유전자형 특성에서. ^(3)이 예는 많은 수의 몇 가지주제에있는 세포의 기계적 표현형 관련이며,이 모든 유용하게 micropost 배열로 조사되었다.

이 글을 쓰는 시점에서, 약 200 기사 세포 micropost 상호 작용을 설명하는 발표되었다. 이 작품은 micropost 편향 원칙의 이론적 인 측면뿐만 아니라 제조에 실제적인 지침을 설명합니다. 세포와 유연한 micropost 배열의 상호 작용을 설명하는 첫 번째 기사는 연속 부드러운 기판을 탄 등 nanonewton 규모의 세포 수축력을 추정하는 데 사용되는 고전적인 견인 힘 현미경 (TFM)과는 대조적으로 2003 년 ⁴ 탄 및 동료에 의해 ​​출판되었다. 실리콘 엘라스토머로 이루어지는 다수의 근접하게 이격 된 수직 빔을 사용하는 방법을 설명했다. 이 기술의 주요 장점은 두 가지 주요 기능에서 등장. 유지하면서 제 휴대 명백 기판의 강성을 변경하기 위해 하나의 유일한 micropost 치수를 변경해야달리 일정하므로, 표면 토폴로지 및 화학의 차이를 피하는 기판 조성물. 둘째 microposts는 이산 개별 초점 유착 정도의 힘과 공간 해상도로 분석 할 수 있습니다 및 표준 TFM에 의해 유사한 분석에 고유 한 분석 문제를 줄일 수있는 개별 스프링과 같은 역할을합니다.

오늘 micropost 배열에 대한 응용 프로그램의 범위는 크게 몇 하나의 셀에 대한 힘의 단지 매핑을 초과합니다. 예를 들어, 아키야마는 곤충 근육 탑재 자율 마이크로 로봇을 개발하기 위해서는, micropost 어레이 액츄에이터 방 애벌레로부터 격리 등쪽 혈관 조직의 사용을보고한다. ⁽⁵⁾

그러나 microposts 대부분의 게시 된 응용 프로그램은 감염이나 암과 같은 질환의 연구에 초점을 맞추고있다. 예를 들어, micropost 어레이는 나이 세리아 gonorrh 번들의 타입 IV의 필리의 구동력 발생을 연구하기 위해 사용되어왔다. 신호 캐스케이드 감염 향상과 연관된 ⁶ 기타 세포 골격 타겟팅 약학 화합물로 처리 유방암 세포를 연구 microposts를 사용한 콜로니 OEA. ⁷

micropost 편향 종종 셀을 가정 단부 하중 고전 캔틸레버 빔 이론을 이용하여 설명하는 매우 micropost의 선단에 부착. 편향 δ 원인이 여기에 적용되는 힘 (F)은 micropost의 "휨 강성"K에 의존에 의해 계산된다 :

(1)

E, I, L 및 인 영률 각각 관성 빔 길이의 면적 모멘트. 기판 휨이 교류로 촬영되지 않습니다 그러나,이 방정식의 결과는 빔 전단 이후 작업뿐만 아니라 굴곡의 힘의 근사치를 제공카운트. microposts 전형적 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)와 같은 부드러운 재료로 제조되는 것을 고려할 때 이러한 요소가 포함될 필요가 실리콘 고무 기반. . Schoen 외는 micropost (L / D) 및 해당 중합체의 포아송 비 (V)의 종횡비에 기초하여 이러한 교정 인자가 있다는 것을 증명 ⁸ 그것은로 주어진다. :

(2)

T _기울기는 (V) 동일한 문서에서 발견 될 수있는 피팅 파라미터 = 1.3를 포함 틸팅 계수되면서 :

(3)

즉 micropost 보정의 강성 K _CORR은 순수한 굽힘 강성 K = K _벤드의 생성물 및 보정 계수 CORR 의미주어진:

(4)

따라서, 셀 력 계산 이제 판독 식 (1)의보다 정교한 변형을 사용하여 수행한다 :

(5)

보정의 영향은 즉시 micropost 치수에 대한 일반적인 값을 사용으로 더 분명해진다. 예를 들면, 원형 단면과 PDMS 계 실리콘 고무로 만들어진 5 ㎛의 직경 15 마이크론 길이 micropost는 0.77의 보정 계수에 이르게하기 때문에 보정 전 계산은 23 %가 소비 된 전지의 힘을 과대 평가한다. 이것은 훨씬 더 심각한 작은 종횡비 microposts에 대한된다.

전통적으로, micropost 이미지 분석은 이상적인 빔 굽힘 이론에 근거하고있다. 2005 년 MICR의 사용을 개척 한 그룹opost 어레이 micropost 분석에 적합한 이미지 분석 소프트웨어를 발표 ⁹ 소프트웨어는 소프트웨어 라이센스가 필요하고 사용자가 각각의 위치에 대한 세 개의 이미지를 취한다.; 전송 모드와 스테인드 세포에 형광 모드에서 또 하나의 micropost의 상단과 하단면에서 한 각. 각각의 상부 및 하부 위치를 비교 한 후 소프트웨어가 힘 벡터 필드를 결정하고, 포스트 당 힘과 같은 관련 파라미터를 계산 micropost. 기타 소프트웨어 패키지는 존재와 그 분석의 원칙은 간단하게 그들을 설명하는 해당 기사에 언급되어 있지만, 이러한 분석 소프트웨어 패키지는 일반적으로 공개적으로 사용할 수 없습니다. ^{(10, 11)}

셀 매핑 힘을 위해 설계 micropost 어레이는 모든 이웃 microposts 사이의 등거리 간격 장점이 후자의 직교 micropost 레이아웃 또는 육각형 하나에 되로 분류 될 수있다. 일반적인 microposts 하원형 단면을 적이 그들의 사이즈 타원 또는 사각형 단면 microposts 또한보고되었다 그러나, 길이가 50 ㎛ 인 내지 1.0 μm의 직경이 10 ㎛ 내지 2. ^(4)를 배열한다. ^12,13

micropost 재료로서 PDMS 기반 실리콘의 혼합물의 혼합물을 사용하는 나노 입자를 추가로 허용한다. 코발트 나노로드를 추가 예를 들어 micropost의 자기 활성화를 가능하게하고, 따라서 잠재적 인 실험 디자인에 자유의 또 다른 학위를 제공합니다. ¹⁴ 대부분의 그룹은 커버 유리와 같은 또는 페트리 접시 내부 평면 딱딱한 기판 상에 자신의 micropost 배열을 생산하고 있습니다. 그러나 맨과 동료들은 최근에 신축 막에 형성된 micropost 배열을보고했다. ¹⁵ 세포 수축성의 관점에서 라이브 셀 세포 내 동적 응답을 공부하는 동안이 부착 세포에 세포 스트레칭 힘의 응용 프로그램을 할 수 있습니다.

널리 사용되는 가장 맛 음료SU8 포토 레지스트를 이용하여 실리콘 웨이퍼 위에 마이크로 구조를 생성하는 데 사용되는 간단한 표준 클린 룸 공정에서 Sniadecki 동료. ^16-18의 통찰력 프로토콜에 기재된 바와 같이 micropost 어레이 제작 오리스 공정은 소프트 리소그래피에 기초한다. 이것은 실리콘 고무 몰드로 이송 구조 위에 캐스팅 된 상기 복사 프로세스가 이어진다. 제 2 단계에서, 이들 몰드 선택된 기판 위에 실리콘 고무를 사용하여 초기 미세 구조를 복제하기 위해 사용된다. 그러나 microposts위한 제조 공정을 확립 그들의 애플리케이션과 관련된 서적의 큰 증가에도 불구하고 마이크로 공학 전문가에도 상당한 시간이 소요; 허용 가능한 품질 레벨을 산출하기 위해 특정 테스트 환경과 micropost 레이아웃 최적화 및 적응을 필요로하는 많은 공정 단계가있다.

상업 micropost 배열은 준비-T에 사용할 수 있습니다지속적으로 높은 품질의 오 사용 ( "기성") 형식입니다. 따라서 그들은 현장 생산에 필요한 복잡하고 긴 제조 공정에 대한 대안이다. 이 논문에서 시판 micropost 어레이는 단일 시야 현미경 이미지를 사용하여 셀룰러 힘을 매핑하는데 사용 하였다. 더 중요한이 문서에서는이 원고에 대한 보충 자료 등을 다운로드 할 수 있습니다 MechProfiler라는 이름의 완전한 기능을 오픈 소스 소프트웨어를 설명합니다. 소프트웨어 적극적 유지 버전도 http://www.orthobiomech.ethz.ch에서 찾을 수있다.

"기성품"분석과 호환 오픈 소스 분석 소프트웨어의 조합은 현저히 TFM 정확한 실험을 달성하기 엔트리 장애물을 낮춘다. 클린 룸 시설이나 소프트웨어 개발 전문 중 하나에 대한 액세스 권한이없는 연구원은 성공적으로 세포의 힘을 분석 할 수 있습니다. 이 메케에 초점을 사용자로 하여금ensitivity 분석 출력보다는 기술 자체, 및 더 넓은 지역에 사용할 견인력을 측정한다. 또한, 이것은 micropost 어레이 전자동 스크리닝 향해 방법을 포장하는 중요한 단계이다.

MechProfiler 분석 소프트웨어는 파일 형식 TIFF, PNG, BMP와 JPG의 이미지를 처리​​합니다. 이미지는 형광, 위상차 또는 밝은 장광 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 독립 실행 형 프로그램은 (이용 가능한 그림 12) 무료 matlab에 컴파일러 런타임과 함께 실행하고 기본 알고리즘은 약 1 분에 하나 또는 여러 개의 세포와 이미지를 처리하는 사용자 수 있도록 효율적인 이미지 처리를 위해 수 있습니다. 또한, 이들 세포 중 살아있는되거나 "고정".

MechProfiler 소프트웨어 크게 상업용 품질 micropost 어레이의 재현성에 의존하여 데이터 분석 처리량을 증가시킬 수있다, 구체적으로는, 기본 및 #8220은 비 – 편향 "배열의 각 포스트의 위치가 이상적 그리드에 대해 추정 될 수있다 (본 연구에 사용 된 배열에서 그리드 제조 편차를 100nm 이하였다).

단 하나의 관심 영역에 작물, 분석 용 이미지 파일의 선택이 열리면 세포에 의해 덮여 게시물을 정의되거나 또는 폐기해야하는 사후 위치를 결정하고, 편향 / 이상적 그리드에 대해 힘을 산출하고, 최종적으로 표준 Office 스프레드 시트에 포함, 수출 가능성을 가진 모든 세포 관련 데이터를 저장합니다.

Protocol

Micropost 배열 1. 배양 세포 참고 : 모든 단계는 불임을 보장하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. 여기에 지정된 볼륨은 T25 세포 배양 플라스크에 대한 것입니다. 세포 배양 배지 및 세포 레시피 파종 밀도 골암 세포주 HuO9 및 M132에 최적화되어있다. micropost 배열에 파종을위한 세포 배양을 준비합니다. 표준 광학 현미경에 배양 플라스크를 배치하여 ?…

Representative Results

설명 된 기술의 주요 장점은 일상적인 실험실 작업에 신속하고 효율적인 통합을위한 단순하고 잠재력에있다. 오픈 소스 소프트웨어와 결합 고품질 상용 센서 어레이의 조합하고자 달리 이미지 분석 소프트웨어 개발의 지식 크린룸 시설 및 심층 액세스해야 – 기계 감도에 대한 정보를 제공한다. (1)가 제공 방법의 흐름을 도시한다. 그것은 micropost 배열에 세포를 준비 시드…

Discussion

이 작품은 실질적으로 진입 기술 및 실제적인 장벽을 낮춤으로써 견인 힘 현미경 분야의 발전을 추구한다. 이 장벽은 양측에서 온다. 가장 먼저 재현성 제조 및 실험적 micropost 배열을 의뢰하기 위해 극복해야 할 많은 비 사소한 기술적 문제가 있습니다. 전형적인 실험이 수백 또는 세포의 수천의 분석이 필요할 수 있습니다 염두에두고 – 둘째, 마찬가지로 적지 않은 단일 셀 힘의 신뢰할 수있는 반…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera