बैक्टीरियल mechanosensitive चैनलों biomolecular उपकरणों में mechanoelectrical transducers के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। छोटी बूंद इंटरफेस bilayers (dibs), इस तरह के उपकरणों के लिए सेल से प्रेरित इमारत ब्लॉकों को शामिल करने और mechanosensitive चैनलों को प्रोत्साहित करने के लिए नए प्लेटफार्म का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहाँ, हम, dibs गठन यांत्रिक उत्तेजना के तहत mechanosensitive चैनलों के अध्ययन की अनुमति का एक नया micropipette आधारित विधि का प्रदर्शन।
MSCL, एक बड़े प्रवाहकत्त्व mechanosensitive चैनल (एमएससी), बैक्टीरिया अचानक हाइपो-आसमाटिक झटके जीवित रहने में मदद करता है कि एक सर्वव्यापी osmolyte रिलीज वाल्व है। यह खोज की है और कड़ाई से लगभग तीन दशकों के लिए पैच दबाना तकनीक का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। पारगम्यता प्रतिक्रिया में कोशिका झिल्ली के लिए लागू तनाव का अनुवाद करने के अपने बुनियादी भूमिका यह कृत्रिम झिल्ली आधारित biomolecular उपकरणों में एक mechanoelectrical ट्रांसड्यूसर के रूप में कार्य करने के लिए एक मजबूत उम्मीदवार बनाती है। इस तरह के उपकरणों के लिए ब्लॉकों इमारत के रूप में कार्य करना, छोटी बूंद इंटरफेस bilayers (dibs) MSCL चैनलों के समावेश और उत्तेजना के लिए एक नया मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम शामिल MSCL चैनलों की गतिविधि dibs फार्म और मापने के लिए एक micropipette आधारित विधि का वर्णन है। इस विधि के दो परस्पर विरोधी (coaxially तैनात) borosilicate ग्लास micropipettes के सुझावों के लिए लंगर लिपिड encased जलीय बूंदों के होते हैं। बूंदों संपर्क में लाया जाता है, जब एक लिपिड bilayer इंटरफेस हैका गठन किया। इस तकनीक को रासायनिक संरचना और प्रत्येक छोटी बूंद के आकार पर नियंत्रण, साथ ही बाईलेयर इंटरफेस के आयाम प्रदान करता है। एक हार्मोनिक पीजोइलेक्ट्रिक क्रियाकारक से जुड़ी micropipettes के एक के बाद एक वांछित oscillatory प्रोत्साहन देने की क्षमता प्रदान करता है। विरूपण के दौरान बूंदों के आकार के विश्लेषण के माध्यम से, इंटरफेस में बनाया तनाव का अनुमान लगाया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करना, एक डीआईबी प्रणाली में MSCL चैनलों की पहली गतिविधि की सूचना दी है। एमएस चैनलों के अलावा, चैनलों के अन्य प्रकार की गतिविधियों को इस मंच की बहु कार्यशीलता साबित हो रही है, इस विधि का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत विधि, मौलिक झिल्ली गुणों की माप के लिए सक्षम बनाता है सममित और असममित झिल्ली के गठन पर अधिक नियंत्रण प्रदान करता है, और उत्तेजित और mechanosensitive चैनलों का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है।
पिछले दशक में, कृत्रिम लिपिड bilayers की विधानसभा में काफी छोटी बूंद इंटरफेस बाईलेयर पद्धति के विकास के माध्यम से उन्नत किया गया है। स्थिर और मजबूत के रूप में जाना जाता है, dibs (मुलर) चित्रित शास्त्रीय और मुड़ा (Montal-मुलर) तलीय bilayers 1 करने के लिए वैकल्पिक मॉडल प्रणाली के रूप में खुद को भी लगाया। लिपिड bilayers बनाने के लिए बूंदों का उपयोग करने का विचार वापस 1960 के दशक 2 करने के लिए तारीखें हालांकि, यह हाल ही में जब तक लोकप्रियता प्राप्त नहीं हुआ है। पहला सफल प्रयास बारले समूह 4-6 से बूंदों के एक नेटवर्क का उपयोग कर बाईलेयर गठन का प्रदर्शन कई अध्ययनों से पीछा Takeushi समूह 3, द्वारा सूचना मिली थी। हाल ही में, encapsulation तकनीक उपन्यास उत्तेजनाओं उत्तरदायी सामग्री प्रणालियों के 10 ब्लॉकों इमारत के रूप dibs उपयोग की अवधारणा जो बीड़ा सिंह समूह 7-9, द्वारा प्रस्तावित किया गया। पिछले अध्ययनों में, dibs बिजली 9,11, केम के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता साबित कर दिया है10,12 राजनैतिक, और ऑप्टिकल उत्तेजनाओं 13। डीआईबी 10,14 में पुनर्गठन जब विभिन्न उत्तेजनाओं उत्तरदायी functionalities के साथ विभिन्न जैवअणुओं प्रभावी रूप से प्रेरित किया गया है। एक महत्वपूर्ण सवाल उठाया है कि इन सफल प्रयास के प्रकाश में: यांत्रिक प्रोत्साहन के लिए डीआईबी जब जवाब उचित जैवअणुओं शामिल कर रहे हैं हो सकता है? एक डीआईबी पर अभिनय इंटरफेसियल बलों अन्य बाईलेयर सिस्टम 15,16 में उन लोगों से भिन्न होते हैं। इसलिए, बूंदों से आयोजित bilayer में तनाव पानी लिपिड तेल इंटरफेस में तनाव के विनियमन के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है; पेंट या मुड़ा बाईलेयर सिस्टम के साथ लागू नहीं एक अवधारणा।
व्यापक रूप से osmolyte रिलीज वाल्व और बैक्टीरियल साइटोप्लास्मिक झिल्ली के मौलिक तत्वों के रूप में जाना जाता है MSCL चैनलों, वृद्धि हुई झिल्ली तनाव 17,18 के लिए प्रतिक्रिया। हाइपो-आसमाटिक झटके की घटना में, कई चैनलों के एक छोटे से सेल की झिल्ली में रहने वाले 19 एक मास उत्पन्न कर सकते हैंनिर्णायक पारगम्यता प्रतिक्रिया जल्दी सेल 20 से बैक्टीरिया बचत, आयनों और छोटे अणुओं जारी करने के लिए। Biophysically, MSCL अच्छी तरह से अध्ययन किया है और प्रमुख पैच दबाना तकनीक 21-23 के माध्यम से मुख्य रूप से होती है। MSCL के gating तंत्र 24,25 समझा विश्वसनीय संरचनात्मक मॉडल अपने homolog के क्रिस्टल 28 मॉडलिंग संरचना 26,27, और व्यापक प्रयोग 24,29-31 के परिणामों के आधार पर प्रस्तावित है। ~ के एक आवेदन तनाव के तहत 10 करोड़ / मी, ट्रांसमेम्ब्रेन सर्पिलों की एक तंग बंडल के होते हैं जो बंद चैनल, एक ~ 28 एक पानी से भरे प्रवाहकीय ताकना 21,24,32 बनाने में काफी झुका सर्पिलों की एक अंगूठी में बदल देती है। यह भी आंतरिक TM1 डोमेन के चौराहे पर तैनात तंग फाटक के hydrophobicity, चैनल 33 के सक्रियण सीमा निर्धारित करता है कि स्थापित किया गया है। तदनुसार, यह पाया गया कि फाटक के hydrophobicity कम करके, tensioएन सीमा 22 से कम किया जा सकता है। MSCL की इस संपत्ति मुख्य रूप से दवा वितरण उद्देश्यों के लिए, विभिन्न चलाया हुआ वाल्व 34 के डिजाइन संभव बनाया। सभी aforementioned संपत्तियों के लिए और electrophysiological गतिविधियों में कोशिका झिल्ली अत्यधिक तनाव का अनुवाद करने में अपनी मौलिक भूमिका पर आधारित, MSCL dibs में एक mechanoelectrical ट्रांसड्यूसर के रूप में एक महान फिट बनाता है।
इस अनुच्छेद में, हम यांत्रिक उत्तेजना के तहत शामिल MSCL चैनलों की गतिविधि dibs फार्म और मापने के लिए एक मूल micropipette आधारित तरीका मौजूद है। हम पहली बार के लिए यांत्रिक प्रोत्साहन और dibs 35 में MSCL की V23T कम दहलीज उत्परिवर्ती के कार्यात्मक पुनर्गठन करने के लिए dibs की प्रतिक्रिया रिपोर्ट।
प्रायोगिक प्रणाली दो परस्पर विरोधी borosilicate ग्लास micropipettes के सुझावों के लिए लंगर लिपिड encased जलीय बूंदों के होते हैं। बूंदों संपर्क में लाया जाता है जब एक लिपिड bilayer इंटरफेस के लिए हैrmed। इस तकनीक में एक छोटी बूंद (थोक) की रासायनिक संरचना और आकार पर नियंत्रण, साथ ही बाईलेयर इंटरफेस के आयाम प्रदान करता है। इसके अलावा, प्रत्येक पत्रक में विभिन्न लिपिड रचनाओं के साथ असममित झिल्ली आसानी से गठित किया जा सकता है। एक हार्मोनिक पीजोइलेक्ट्रिक क्रियाकारक से जुड़ी micropipettes के एक के बाद एक पूर्व क्रमादेशित एकल चक्र या oscillatory प्रोत्साहन लागू करने की क्षमता प्रदान करता है। तनाव इसका समर्थन दोनों बूंदों के संपीड़न के माध्यम से कृत्रिम झिल्ली को दिया है। छोटी बूंद विरूपण का एक परिणाम के रूप में, पानी-लिपिड तेल इंटरफेस वृद्धि हुई है, और साथ ही साथ बूंदों के बीच कोण के क्षेत्रों झिल्ली तनाव और क्षणिक MSCL सक्रियण में वृद्धि के कारण कम हो जाती है। विरूपण के दौरान बूंदों के आकार के विश्लेषण के माध्यम से, इंटरफेस में बनाया तनाव का अनुमान लगाया जा सकता है। इस लेख में ध्यान डीआईबी के Mechano पारगमन गुणों पर है, भले ही हम यह भी जोर है कि अन्य प्रकार की जैवऐसे alamethicin के रूप में अणुओं, इस बहुआयामी मंच से सक्रिय किया जा सकता है। हम तैयारी संयोजन, और एक कदम-दर-कदम तरीके से इस नई विधि के साथ माप लेने के सभी तकनीकी पहलुओं को, यहाँ प्रस्तुत करते हैं।
Mechanosensation रहने वाले जीवों में विकसित किया है कि पहले संवेदी पारगमन रास्ते में से एक का प्रतीक है। अध्ययन और डीआईबी के Mechano-बिजली के गुणों को समझने के लिए इस घटना का उपयोग करना, कार्यात्मक उत्तेजनाओं उत्तरदायी सामग्री की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है। यह एक mechanoelectrical ट्रांसड्यूसर और लिपिड bilayer इंटरफ़ेस में तनाव बढ़ाने का पता लगाने के लिए एक तनाव गेज के रूप में डीआईबी में एक mechanosensitive चैनल, MSCL, के समावेश और सक्रियण शामिल है। एक और नोट पर, एमएस चैनलों के समारोह मोटाई, आंतरिक वक्रता, और दबाव सहित लिपिड bilayers की बुनियादी गुण सामग्री के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है। ऊपर उल्लिखित के प्रकाश में, micropipette आधारित तकनीक शोधकर्ता dibs में एमएस चैनलों का अध्ययन करने और लिपिड bilayer की संरचना, साथ ही लिपिड, प्रोटीन बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता अनुमति के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
पिछले तीन दशक के दौरानएस, पैच दबाना यह वोल्टेज और तनाव दोनों के clamping की अनुमति देता है के बाद से, एमएस चैनलों का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक तरीका था। हालांकि, पैच दबाना भारी उपकरण और miniaturization, संवेदी और रूपांतरण उपकरणों के इंजीनियरिंग के लिए आवश्यक एक संपत्ति के लिए उपयुक्त नहीं की आवश्यकता है। उनकी सादगी, स्थिरता, और compactness के कारण dibs MSCL की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त वातावरण प्रतिनिधित्व करते हैं। यहाँ, हम बूंदों और bilayer इंटरफेस के आकार, प्रत्येक छोटी बूंद की रासायनिक संरचना, और गतिशील उत्तेजना के माध्यम से इंटरफेस में तनाव को नियंत्रित करने की क्षमता के साथ, एक micropipette आधारित तकनीक का प्रस्ताव द्वारा डीआईबी गठन तकनीक में पिछले अग्रिमों का विस्तार। तकनीक coaxially कांच केशिकाओं का विरोध करने के सुझावों के लिए, proteoliposomes युक्त, जलीय बूंदों प्रस्तोता के होते हैं। संपर्क में इंटरफेस में एक लिपिड bilayer रूपों लाया जब बूंदों कार्बनिक विलायक के एक स्नान में रखा गया है और कर रहे हैं।
micropipettes पी से जुड़े होते हैंबूंदों की क्षैतिज विस्थापन की इजाजत दी iezoelectric oscillators,। गतिशील पानी तेल इंटरफेस में इंटरफेसियल तनाव की वृद्धि हुई है और इसलिए बाईलेयर तनाव में वृद्धि की बूंदों, परिणाम compressing। दो प्रमुख पहलुओं के समान है और हाल ही में प्रकाशित संपर्क बुलबुला बाईलेयर (सीबीबी) तकनीक 37 से इस विधि को अलग। इस के साथ साथ प्रस्तुत तकनीक का उपयोग करना, bilayer के आकार micromanipulators का उपयोग नियंत्रित किया जाता है और इस तरह की बूंदों की मात्रा CBB विधि के विपरीत है, लगातार बने हुए हैं। इसके अलावा, सीबीबी तकनीक यह सरल और आसान बनाने के लिए कर रही है इस पत्र में प्रस्तुत विधि में जरूरत नहीं कर रहे हैं, जो दबाव पंप, के लिए कहता है।
हम शामिल करने और एक पैच पिपेट या रासायनिक संशोधनों 38 के उपयोग के बिना पहली बार के लिए जीवाणु MSCL को प्रोत्साहित करने में सक्षम हैं। प्रणाली मजबूत असममित लिपिड bilayer झिल्ली के गठन की सुविधा के बाद से, यह और अधिक बारीकी से एल mimicsजैविक झिल्लियों में पाया ipid विषमता। इस MSCL की गतिविधि पर नियंत्रित झिल्ली रचना या विषमता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए हमें की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, इमेज प्रोसेसिंग तकनीक के माध्यम से, इस विधि बाईलेयर इंटरफेस में तनाव का अनुमान मदद करता है। डीआईबी में थोक और सतह बलों के बीच interconversion के सिद्धांतों को समझने में इस तकनीक सहायता, मौलिक झिल्ली संपत्तियों की माप की सुविधा है, और तनाव झिल्ली MSCL प्रतिक्रिया की समझ को बेहतर बनाता है।
इस विधि MSCL अध्ययन करने के लिए एक कदम और करीब एक biomolecular उत्तेजनाओं उत्तरदायी सामग्री प्रणाली की ओर है और एक अलग मनोवैज्ञानिक वातावरण के लिए ले जाता है, इस प्रणाली के लिए सीमाएं हैं। इस प्रणाली में तनाव की वजह से तेल / पानी इंटरफेस में तनाव को दूर करने के लिए जाता है, जो हर छोटी बूंद में लिपिड के रूप में लिपिड जलाशय की उपस्थिति के लिए कर्फ्यू लगा दिया नहीं जा सकता है। इसलिए, वर्तमान mechanosensitive चैनलों पर प्रेरित किया जा सकताकेवल एक गतिशील शासन में dibs में। प्रणाली में हवा के बुलबुले की उपस्थिति काफी प्रयोगों की परिशुद्धता और reproducibility प्रभावित करता है। हाइड्रोजेल में मौजूद हवा के बुलबुले बिजली के कनेक्शन है, तो नुकसान हो सकता है।
हम MSCL की उत्तेजना के लिए सूक्ष्म पिपेट आधारित पद्धति के उपयोग का वर्णन करते हैं, तकनीक एमएस चैनलों के अन्य प्रकार का अध्ययन किया और biomolecules की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है हो सकता है। उदाहरण के लिए, इसी तरह की स्थापना एक चैनल से मुक्त छोटी बूंद इंटरफेस bilayer झिल्ली की mechanoelectrical प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया गया है। विभिन्न प्रोटीन का पुनर्गठन किया है और प्रत्येक बायोमोलिक्यूल के पुनर्गठन के वातावरण भिन्न है कि विचार में लेने के इस अत्यधिक नियंत्रित सेटअप का उपयोग कर सक्रिय किया जा सकता है। इस आलेख में वर्णित विधि केवल शोधकर्ता की कल्पना तक ही सीमित रहा है कि एक काफी व्यापक आवेदन क्षमता पर छू लेती है।
The authors have nothing to disclose.
इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान वैज्ञानिक अनुसंधान बुनियादी पहल अनुदान FA9550-12-1-0464 की वायु सेना के कार्यालय द्वारा समर्थित है।
0.22 µm filter | Corning | 430624 | |
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | Purchased as lyophilized powder |
34-gauge microfil | World Precision Instruments | MF24G-5 | |
400 mL Centrifuge bottels | ThermoFisher | 3141 | Nalgene |
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz | Keysight Technologies | 33220A | |
Ampicillian | ThermoFisher | BP1760 | ACS Grade |
Avanti® Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | – | |
AxioCam HSm | Carl Zeiss | – | |
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | – | |
BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Dialysis tubing | 7 Spectra/Por | 132113 | MWCO 8000, 7.5 mm diameter |
DigiData 1440A system | Molecular Devices | – | |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
DPhPC | Avanti | 850356C | |
E-625 PZT Servo-Controller | Physik Instrumente | E-526 | |
FPLC System | Pharmacia Biotech | – | |
HCl | J.T. Baker | 9535-33 | |
Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
Homoginizer | Wheaton | 357426 | 15 mL |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Affymetrix | 17886 | |
IRGACURE® 2959 | IRGACURE® | 555047962 | |
Isopore Membrane Filters | EMD Millipore | VCTP02500 | |
Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACS Grade |
KH2PO4 | Mallinckrodt | 7100 | ACS Grade |
Kimble-Chase | Kontes | 420401-1515 | Flex-Column |
LED-100 UV Spot Curing System | Electro-Lite, corp. | 81170 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Manual Patch-Clamp Micromanipulators | Thorlabs | PCS-520N | |
MgCl2 | ThermoFisher | M33 | ACS Grade |
Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
MOPS, minimum 99.5% titration | Sigma-Aldrich | M1254-100G | |
N2 Gas | Airgas | UN1066 | |
NaCl | EMD | SX0420-1 | ACS Grade |
Ni NTA agarose beads | Qiagen | 1000632 | |
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID | McMaster-Carr | 8486K545 | |
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator | Physik Instrumente | P-601 | |
PAGE gel | Bio-Rad | 456-9033 | |
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film | Parafilm® | PM999 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate | Polysciences, Inc. | 15178-100 | |
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk | Sterlitech Corporation | PCTB0425100 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405-500G | |
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
Replacement Gasket 1.0mm | World Precision Instruments | GO1-100 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L5750 | |
Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
Sodium Azide | Affymetrix | 21610 | |
Test tubes | ThermoFisher | 14-961-27 | 12 x 130 mm |
Tryptone | ThermoFisher | BP1421 | |
Ultracal 30K | Millipore | UFC803024 | Amicore Ultra 30 MWCO |
VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 | |
Water Purifier | Barnstead | D11931 | |
Yeast | ThermoFisher | BP1422 | |
β-octylglucopyranoside | Anatrace | O311S |