Bakteriel Leaf Infiltration Assay til Fin karakterisering af Plant Defense Responses ved hjælp af<em> Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em> Pathosystem
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
I mangel af specialiserede mobile immunceller, planter udnytte deres lokaliserede programmeret celledød og systemisk erhvervet resistens til at forsvare sig mod patogen angreb. Bidraget af en specifik Arabidopsis gen immunrespons hele anlægget kan være specifikt og kvantitativt vurderet ved at analysere patogenet vækst inden det inficerede væv. I mere end tre årtier har hemibiotrophic bakterie Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) i vid udstrækning blevet anvendt som model patogen til at undersøge de molekylære mekanismer der ligger til grund respons Arabidopsis immunrespons. At levere patogener i bladet væv, er der etableret flere podning metoder, fx sprøjte infiltration, dip podning, spray, vakuum infiltration, og oversvømmelse podning. Følgende protokol beskriver en optimeret sprøjte infiltration metode til at levere virulente Psm ES4326 i blade af voksnejord-dyrket Arabidopsis planter og præcist screene for øget sygdom modtagelighed (EDS) mod dette patogen. Desuden kan denne protokol suppleres med flere forbehandlinger til yderligere dissekere specifikke immundefekter inden for forskellige lag af vegetabilsk forsvar, herunder salicylsyre (SA) -Triggered immunitet (STI) og MAMP-udløste immunitet (MTI).
Introduction
På grund af deres sessile natur er planter til stadighed truet af en overflod af patogener udviser forskellige livsstil og ernæringsmæssige strategier 1. Til en første tilnærmelse, biotrofe patogener opretholde deres vært i live til at hente næringsstoffer, mens necrotrophic patogener aktivt hemmelige toksiner og enzymer til at dræbe vært væv og foder på de døde celler 1. En anden gruppe af patogener, betegnes hemibiotrophs, begynder deres infektion kursus med den biotrofe scene og skift til den necrotrophic etape efter at have nået en vis tærskel af patogen ophobning 2. For effektivt at forsvare sig mod disse mikroorganismer, planter har udviklet et kompliceret medfødte immunsystem udstyret med flere overvågningsmekanismer til påvisning patogenet angreb og udløse lokaliseret programmeret celledød 3 samt Systemisk erhvervet resistens (SAR) 4. Aktuel forskning er fokuseret på at karakterisere de væsentlige SIGnaling komponenter og cross-samtaler inden anlægget immunsystemet 5.
Som foreslået i "siksak" model 5, det første lag af respons anlægget medfødte immunforsvar kræver tilstedeværelsen af plasmamembran-lokaliserede mønstergenkendelse receptorer (PRRS) for at detektere invasionen af en mikrobe. PRRS er i stand til at genkende Microbe-associerede Molekylære mønstre (MAMPs) og etablere MAMP-udløst immunitet (MTI) 6. Udover at inducere et transkriptionelt opregulering af gener, der koder antimikrobielle PR-proteiner 7, MTI fører til en række arrangementer, der standser patogen vækst, herunder produktion af reaktive oxygenarter (ROS) og reaktiv nitrogenforbindelser (RNS), aflejring af callose til cellevæggen samt aktiveringen af multiple kinase signalveje 8.
Indtil nu har flere MAMPs blevet identificeret til at udløse MTI i Arabidopsis, herunder bakteriel flg22 9 </sup> (En 22 aminosyre fragment afledt af flagellin), elf18 10 (18 aminosyrer fra den bakterielle oversættelse elongeringsfaktor Tu) og en strukturel cellevægsbestanddel peptidoglycaner 11. At etablere en succesfuld infektion, har nogle specialiserede patogener udviklet evnen til hemmelige virulens effektor proteiner i de intracellulære eller intercellulære rum, og dermed undertrykke MTI og udløse Effector-udløst Følsomhed (ETS) 12,13. For eksempel kan virulens effektorer inaktivere mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) phosphorylering kaskader af MTI at inducere udvikling af sygdommen i inficerede væv 14-16. Under den dynamiske co-evolution mellem værter og patogener, planter også udviklet kontra strategi for at anerkende de effektor proteiner, og dæmpe patogen virulens molekyler 17. Denne direkte eller indirekte effektor anerkendelse medieres af sygdomsresistens (R) proteiner 18. De fleste af them er medlemmer af NB-LRR (nucleotidbindende og leucin-rige gentagelser) familie 19. Opfattelsen af en avirulent effektor af en R protein fremkalder en stærkere og bredere immunrespons karakteriseret som Effector-udløst immunitet (ETI) 20. Udover at inducere ekspressionen af forsvar gener 21 og produktionen af forsvarsprodukter metabolitter 22, ETI ofte fører til en hurtig lokaliseret programmeret celledød kendt som Overfølsomme Response (HR) for at begrænse patogenet spredes i tilstødende væv 3.
Ud over de lokaliserede programmeret celledød 23, planter er i stand til at initiere en langsigtet og immunrespons hele systemet betegnes Systemisk erhvervet resistens (SAR) 4. Efter belastning med en biotrofe patogen, planteceller udløser biosyntesen og akkumulering af et endogent phytohormonet salicylsyre (SA) og PR-proteiner i både lokale og systemiske væv 24. Gennem thans proces, er en forhøjet beredskab opnået i de inficerede blade, der giver mulighed for montering hurtigere forsvar reaktioner under en efterfølgende infektion med et bredt spektrum af patogener 24. SA og dets syntetiske analoger, såsom benzo- (1,2,3) thiadiazol-7-carbothiosyre S-methylester (BTH) og 2,6-dichloroisonicotinic acid (INA) er i stand til kemisk at inducere salicylsyre (SA) -Triggered immunitet (STI) ved eksternt program 24. Nonexpressor i de sygdomsfremkaldende gener 1 (Npr1) foreslås at være en af de SA receptorer og fungerer som en stor transkriptionel regulator under SA-medieret forsvar reaktion i både lokale og systemiske væv 21,25,26. Det er blevet endegyldigt bevist, at Npr1 er nødvendig for SAR etablering og tabet af Npr1 fører til dramatiske modtagelighed over for Pseudomonas syringae 25.
Ekstensivt karakterisere molekylære bidrag anlægkomponenter i plante-patogen interaktioner, er der udviklet flere bioassays til at måle specifikke forsvar begivenheder, herunder ROS brast 27, callose deposition 28, forsvar gener udtryk og akkumulering af deres proteinprodukter 21. Mens disse enkelte assays kan give indsigt i en særlig form for immunreaktion anlægget, ingen af dem, er imidlertid i stand til at repræsentere den fuldstændige forsvarsrespons på helplanteniveau. Omvendt kvantificering af patogen vækst efter infektion giver en overordnet vurdering af immunrespons på organismal niveau. Derfor er udvikling og optimering af en præcis og yderst standardiseret patogen podning analysen er afgørende for brændstof op af forskning og opdagelser på Arabidopsis immunreaktioner.
Pseudomonas syringae, en gram-negativ bakterie, blev identificeret som en phytopathogen stand til at forårsage sygdom hos en række plantearter værter, herunder Arabidopser 29. Som modelplante-patogen systemet, Arabidopsis – P. syringae interaktion har været almindeligt anvendt til at forstå de molekylære mekanismer underliggende plante forsvarsmekanismer reaktioner 29. Hidtil over 50 s syringae pathovars er blevet identificeret baseret på deres evne til at inficere forskellige plantearter 30 . P. syringae pv. tomat DC3000 (Pst DC3000) 31 og P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 er de to mest anvendte og omfattende karakteriseret virulente stammer. Bortset fra at blive anerkendt af anlægget og udløser MTI respons, Pst DC3000 og PSM ES4326 er i stand til at udskille virulente effektor proteiner at undertrykke MTI og udløse ETS til at favorisere 31,33 patogen vækst.
Til funktionelt dissekere interaktionen mellem Arabidopsis og P. syringae, multipelDer er blevet udviklet patogeninfektion metoder baseret på patogenet levering tilgang; 0. For jord dyrket planter, kan patogen leveres med en sprøjte infiltration, vakuum infiltration, dip podning og spray podning 29,34. For nylig blev sætteplante oversvømmelse-podning assay udviklet til at udføre store skærme på vævskulturplader dyrket unge Arabidopsis planter 35. Sprøjte infiltration, som en af de mest almindeligt anvendte fremgangsmåde, leverer patogenet i apoplasten gennem naturlige blad åbninger betegnes stomata 29 manuelt. Gennem denne tilgang, lige store mængder af P. syringae kan infiltreret i det inficerede blade og styrken af immunrespons anlægget er omvendt korreleret med niveauerne patogen vækst. Derfor kvantificering af patogen vækst tjener som en optimal tilgang til at evaluere immunfunktionen på helplanteniveau. Derudover kan sprøjten infiltration skelne det lokale og systemiske væv, som kan be der gælder i karakterisering af molekylære mekanismer der ligger til grund SAR 36.
I det følgende protokol, beskriver vi en optimeret sprøjte infiltration assay med Psm ES4326 at screene Arabidopsis mutanter for øget sygdom modtagelighed (EDS). Denne protokol vil ansætte to Arabidopsis genotyper: en vildtype økotype Columbia-0 (Col-0) planter (kontrol) og npr1-1 tab-of-funktion mutanter (hypersusceptible) der vil blive inficeret med virulent bakteriestamme Psm ES4326 37. Den npr1-1 mutant bærer en punktmutation i ankyrin-repeat konsensussekvens af Npr1 molekylet, som ændrer den meget konserverede histidin til tyrosin og gør proteinet ikke-funktionelt 25. Desuden er en række ændringer af sprøjten infiltration analysen beskrevet, at tillader kvantificering af fejl i de specifikke lag af immunrespons, herunder MTI og STI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med faldende tilgængelige landbrugsjord og stigende befolkning er forskere rundt om i verden udfordret med presserende behov for afgrøden forbedring. Udbyttet kan blive kraftigt påvirket af forskellige biotiske og abiotiske påvirkninger. Blandt dem, patogen infektion er en af de førende årsager til høstudbytte reduktion, der er ansvarlig for ca. 12% tab i USA alene 45. Du kan løse problemet, er massiv forskning udført i modellen Arabidopsis – P. syringae pathosystem til omfattende karakteris…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
Riferimenti
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity – direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses – the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
