Efficiente protocollo Isolamento da B e T linfociti umani da Palatine Tonsille

Summary

Le tonsille palatine sono una ricca fonte di linfociti B e T. Qui forniamo un protocollo facile, efficiente e rapido per isolare i linfociti B e T dalle tonsille palatine umane. Il metodo descritto è stato specificamente adattato per gli studi sull'eziologia virale dell'infiammazione delle tonsille nota come tonsillite.

Abstract

Le tonsille formano una parte del sistema immunitario che fornisce la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni inalati. Solitamente il termine "tonsille" si riferisce alle tonsille palatine situate alle pareti laterali della parte orale della faringe. Le tonsille palatine rimosse chirurgicamente forniscono una comoda fonte accessibile di linfociti B e T per studiare l'interazione tra agenti patogeni estranei e il sistema immunitario dell'ospite. Questo protocollo video descrive la dissezione e l'elaborazione delle tonsille palatine umane rimosse chirurgicamente, seguite dall'isolamento delle singole popolazioni di cellule B e T dallo stesso campione di tessuto. Presentiamo un metodo che separa in modo efficiente i linfociti tonsillari B e T utilizzando un protocollo di affinità anticorpo-dipendente. Inoltre, utilizziamo il metodo per dimostrare che l'adenovirus umano infetta specificamente la frazione di cellule T tonsillari. Il protocollo stabilito è generalmente applicabile per isolare in modo efficiente e rapido le popolazioni di cellule B e T tonsillari per studiare il ruolo di diversi tipi di patogeni nelle risposte immunitarie tonsillari.

Introduction

Le tonsille sono raccolte di tessuti linfoidi incapsulati in modo incompleto che si trovano sotto e a contatto con l'epitelio nel tratto aero-digestivo superiore. Solitamente il termine "tonsille" si riferisce alle tonsille palatine situate alle pareti laterali della parte orale della faringe. Le tonsille palatine accoppiate insieme alla tonsilla nasofaringea (adenoide), alle tonsille tubariche appaiate e alle tonsille linguali costituiscono il cosiddetto "anello di Waldeyer". Quest'ultimo è responsabile del contatto iniziale tra gli agenti patogeni inalati o ingeriti e i tessuti linfoidi del tratto aerodigestivo^1,2. Infatti, numerosi studi hanno dimostrato....

Protocol

Il protocollo descrive l'isolamento di cellule linfoidi dal materiale umano paziente e richiede quindi l'approvazione etica. Il lavoro svolto in questo studio è stata concessa dalla Uppsala Ethical Review Board (DNR. 2013/387).

1. Isolamento di cellule mononucleate (MNC) da umani Palatine Tonsille

ATTENZIONE: Tutto il materiale non schermati di origine umana come sangue, tessuti o fluidi corporei dovrebbe essere considerato come materiale potenzialmente infetto. Pertanto, pratiche di biosicurezza consigliate per la manipolazione dei tessuti umani devono essere seguite.

Nota: ....

Results

Una separazione efficace dei tonsillari MNC risultati in sottopopolazioni altamente purificate di linfociti B e T. Ciò è stato confermato mediante analisi FACS utilizzando anti-CD20 e anti-CD2 per rilevare B T linfociti popolazioni, rispettivamente (Figura 3A). Al contrario, una separazione efficiente di MNC risultati in frazioni cellulari che sono una miscela di cellule di entrambe le sottopopolazioni di linfociti B e T (Figura 3B).

Il linfociti T (.......

Discussion

Uno dei fattori più importanti che influenzano il risultato di questo protocollo è l'uso di materiale fresco tonsillare come materiale di partenza. Pertanto, i campioni di tonsille devono essere trattati entro 3 ore dopo l'intervento chirurgico. Tonsille possono essere ottenuti da adulti e bambini. Il materiale tonsillare dai bambini è di solito più piccoli a causa della rimozione chirurgica parziale delle tonsille (tonsillotomy). Pertanto, il numero di multinazionali ottenuti da campioni tonsillotomia (1 x 10 <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)	Gibco	14175-053	Contiene il 5% di siero fetale bovino (FBS), 10 mM di glutammina, 0,05 mg/ml di gentamicina e 1% di miscela antibiotico-antimicotica
		di congelamento	90% FBS e 10% DMSO tampone
MACS			PBS (pH 7,2), 0,5% BSA e 2mM EDTA
PBSA			PBS contenente lo 0,2% di BSA
, PFA			PBS contenente l'1% di paraformaldeide (PFA). Prepara fresco. Il PFA è sospettato di essere cancerogeno. Indossare guanti e occhiali.
Miscela antibiotico-antimicotica	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Forbici da dissezione Fisher		Scientific 1381241
Forbici per iride diritte	Fisher Scientific	12912055
bisturi monouso	Swann-Morton	REF 0501
100 μ m filtro cellulare in plastica	Corning Life Sciences	352360
40 μ m filtri per celle in plastica	Corning Life Sciences	352340
Siringa in plastica da 2 ml	BD Biosciences
provette da centrifuga coniche da 15 ml	SARSTEDT	62554502
provette da centrifuga coniche da 50 ml	SARSTEDT	62547254
Centrifuga a bassa velocità con rotore ad angolo fisso o a secchiello oscillante	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll– Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll soluzione
Fetale di vitello Biological	industries	040071A
Dimetil solfossido (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML MACS
MS colonne	Miltenyi Biotec	130-042-201
Microsfere CD3 umane MACS	Miltenyi Biotec	130-092-881
Separatore MACS (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Albumina sierica bovina (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 coniugato alloficocianina ( CD2-APC)	BD Bioscienze
CD20 coniugato all'isotiocianato di fluoresceina (CD20-FITC)	BD Bioscienze
Siero umano	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	Thermo Scientific	F-530L
tubi FACS	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII citometro	a flusso BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 software	BD Biosciences
Sangue Nucleospin	Macherey-Nagel	740951.50	Kit di isolamento del DNA
Reagente TRIzol	Tecnologie di vita	15596	Reagente di isolamento dell'RNA
Emocitometro	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	dispositivo contacellule
GelRed	Biotium	41003	Colorazione su gel di acido nucleico