Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.
Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) er en førende årsag til synshandicap i den udviklede verden. Sygdommen manifesterer sig ved ødelæggelsen af centrum af nethinden, kaldet macula, hvilket resulterer i tab af det centrale syn. Tidlig AMD er karakteriseret ved tilstedeværelsen af små, gullige læsioner såkaldte bløde drusen, der kan udvikle sig på slutningen af AMD såsom geografisk atrofi (tør AMD) eller neovaskularisering (våd AMD). Selvom de kliniske ændringer er godt beskrevet, og forståelsen af genetiske påvirkninger af overdragelse AMD risiko bliver stadig mere detaljeret, et område der mangler store fremskridt er en forståelse af de biokemiske konsekvenser af genetiske risiko. Dette skyldes til dels problemer med at forstå biokemi Bruchs membran, en meget tynd ekstracellulære matrix, der fungerer som et biologisk filter af materiale fra blodforsyning og et stillads, hvor den retinale pigment epitel (RPE) cellemonolaget bor. Drusen form inden Bruchs membran og deres tilstedeværelse forstyrrer næringsstoffer flow til RPE celler. Kun ved at undersøge protein sammensætning Bruchs membran, og faktisk hvor andre proteiner interagerer med det, kan forskerne håber at opklare de biokemiske mekanismer der ligger til grund drusen dannelse, udvikling af AMD og efterfølgende synstab. Dette papir beskriver metoder til berigelse enten hele Bruchs membran, eller bare fra macula regionen, så den kan bruges til nedstrøms biokemisk analyse, og giver eksempler på, hvordan det er allerede ændre forståelsen af Bruchs membran biokemi.
Brugen af post mortem øjenvæv menneske i oftalmologiske forskning er en uvurderlig ressource for forståelsen af øjensygdom patogenese. Analyse af human donor øjne har ydet vigtige bidrag til kræsne de mekanismer der ligger til grund aldersrelateret makuladegeneration (AMD), som er den hyppigste årsag til blindhed i den vestlige verden 1. Globalt AMD tegner sig for ca. 8,7% af al blindhed og med en stadig mere aldrende befolkning, er det forventes at påvirke 196 millioner mennesker i 2020 2. AMD resulterer i tab af det centrale syn og har en dybtgående indvirkning på patientens uafhængighed og livskvalitet 3. Tidlig AMD er karakteriseret ved dannelsen af drusen og det kan udvikle sig til geografisk atrofi (undertiden benævnt "tørre" AMD), eller choroideaneovaskularisering (også benævnt neovaskulær eller "våde" AMD). Mens anti-VEGF injektioner kan stabilisere eller forbedre vision i neovaskulær AMD det jeger ikke helbredende, og på nuværende tidspunkt, findes der ingen behandling for geografisk atrofi.
Mens visse genetiske varianter har vist sig at ændre AMD risiko 4 – 8, er mindre kendt om, hvordan disse varianter påvirker macula på et biokemisk niveau. Et vigtigt sted i AMD patogenese er Bruchs membran. Drusen form inden denne struktur og forskellige undersøgelser har fremlagt dokumentation for komplement aktivering i og omkring Bruchs membran i AMD 9. Bruchs membran er et ark af ekstracellulær matrix, der adskiller de retinale pigment epitel (RPE) celler fra årehinden, og er ca. 4 um tyk. Bruchs membran fletter ind i choriocapillaris, et lag af årehinden, der indeholder fenestrerede kapillærer og uden for denne er lag indeholdende større blodkar 10 (figur 1A).
Bruchs membran er en pentilaminar ark ekstramatrix (ECM), og denne metode detaljer hvordan man isolerer Bruchs membran, sammen med ECM af de underliggende choriocapillaris (herefter benævnt beriget Bruchs membran), hvilket stort set decellulariserede og fri for røde blodlegemer. Enriched Bruchs membran blev derefter anvendt til Western blotting og histologiske forsøg. Endvidere beskrives metode til at berige Bruchs membran alene fra macula område af øjet, hvilket vil være af særlig interesse for dem at undersøge de biokemiske aspekter af AMD.
Her beskriver vi berigelsen af Bruchs membran til yderligere analyse tillader efterfølgende analyser herunder western blotting 11, massespektrometri og udbredelse egenskaber Bruchs membran under anvendelse af modificeret Ussing kamre 11,14. Kritiske trin omfatter a) grundig skrabning og vask af den indre overflade af øjet for at fjerne alle RPE B-celler) den gentagne og omhyggelig skrabning af den underliggende choroid uden at forårsage Bruchs at gå i opløsning og c) vask af den udskårne Bruchs i ultrarent vand at sikre lysis af tilbageværende celler. Desuden, hvis den berigede Bruchs membran skal anvendes til proteomanalyse, protein ekstraktion med urinstof behandling er den mest effektive til at nedbryde denne elastiske væv sammenlignet med andre fremgangsmåder, såsom mekanisk homogenisering. Histologi af beriget Bruchs membran angiver ECM af choriocapillaris er ikke fjernet. Dette er for at være exventet som det ydre lag af pentilaminar Bruchs membran er dannet af choriocapillaris endotelcelle-basalmembraner. Faktisk kan det være fordelagtigt, at ECM af choriocapillaris forbliver som der sker ændringer i det i AMD herunder deposition af terminalen komplementkompleks / membran (MAC) 15. Det skal bemærkes, at for detaljeret histologisk analyse af Bruchs membran, dets struktur ville være bedre bevaret, hvis snit i nærvær af sclera, choroidea og Bruchs membran. Faktisk er histologi præsenteret i figur 2 udelukkende til formål at demonstrere graden af berigelse som følge af teknikken beskrevet i dette manuskript.
Berigelse af makulært Bruchs kræver omhyggelig dissektion af øjestykket, der sikrer, at NSR og især fovea ikke beskadiges; ellers identifikation og dermed isolering af macula er ikke mulige. Integriteten af tissue er også vigtigt at denne proces, og det anbefales derfor, at prøverne under 48 timer post mortem tidspunkt anvendes. Graden af berigelse kræves varierer mellem donorer og kan påvirkes af donor alder, post mortem tid, og tilstedeværelsen af en hvilken som helst øjet patologi. Brugen af udtrykket beriget er bevidst i at anerkende en begrænsning af den teknik, hvilket er at "rensning" eller "isolation" af Bruchs membran ved hjælp af denne metode er simpelthen ikke muligt. I betragtning, at ECM af choriocapillaris går over i Bruchs membran der fuldstændig adskillelse ikke er mulig.
Er vigtigt at forstå øjensygdom progression forstå de biokemiske forandringer af de respektive øjenvæv. Denne unikke berigelse af Bruchs membran letter denne forståelse; igangværende studier undersøger proteom af beriget makulært Bruchs membran under anvendelse af massespektrometri på forskellige stadier af AMDog i prøver stammer fra individer med forskellige genotyper at forbedre forståelsen af den molekylære patologi for AMD. Allerede her beskrevne teknik er blevet anvendt til at identificere FHL-1 som den dominerende supplement regulator i membran 11 og yderligere undersøgelser Bruchs på beriget Bruchs membran vil sandsynligvis resultere i flere nye indsigter i den molekylære patologi AMD.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Isaac Zambrano og personalet på Manchester Eye Hospital Eye Bank for levering af human donor øje væv, og Mr. Pete Walker fra Det Biovidenskabelige Fakultet Histologi facilitet for H & E-farvede billeder. Særlig tak går til Mr. Roger Meadows for hans hjælp med mikroskopi. SJC er en modtager af en Medical Research Council (MRC) Karriereudvikling Fellowship (MR / K024418 / 1) og forfatterne også anerkender andre nylige forskningsmidler fra MRC (G0900538 og K004441), Kæmp for Sight (1866) og The Macula Society.
Auxillary objective 0.5x | GT-Vision Ltd | 3638 | Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount |
Biopsy Punch 6mm | Oncall Medical Supplies | SCH-33-36 | 6mm Biopsy Punches |
Bovine serum albumin | Sigma – Aldrich | A3059 | |
Bromophenol Blue | Sigma – Aldrich | B0126 | |
Cell scrapers | Sarstedt | 83.183 | For membrane enrichment |
CyroPure Cyrovials | Sarstedt | 72.38 | |
Disposable Scalpels | Fisher Scientific | 12387999 | Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels. |
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms | GT-Vision Ltd | 0153 | Flexible light source essential for dissection and imaging |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma – Aldrich | D8537 | Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment. |
(A) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4280 | (A) Fine (100mm) and straight |
(B) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4272 | (B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample |
(C) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4323 | (C) Straight fine points |
Glycerol | Sigma – Aldrich | G1345 | |
Glycine | Sigma – Aldrich | B0126 | |
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software | GT-Vision Ltd | 1122 | |
Methanol | Sigma – Aldrich | M/4000/17 | |
Nitrocellulose membrane | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Life Technologies | NP0322BOX | |
Petri dish | Sterilin | 101VR20 | 90mm, used as a dish for samples |
Protein isolation beads (Strataclean resin) | Agilent | 400714-61 | |
SDS | Bio-Rad | 161-0301 | |
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x) | GT-Vision Ltd | 5595 | Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection |
Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T3253 |