Generation og Kultur of Blood Udvækst endotelceller fra human perifert blod

Summary

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Abstract

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Introduction

Indtil for nylig var den postnatale generation af nye blodkar menes at forekomme udelukkende gennem en proces kendt som angiogenese, defineret som spiring af nye skibe fra endotelceller af allerede eksisterende fartøjer. ^1. Denne proces kontraster fra vaskulogenese, eller de novo dannelsen af blodkar fra endotelceller progenitorer, som blev anset for at forekomme udelukkende under embryogenese. ² har imidlertid nyere undersøgelser identificeres og isoleres cirkulerende endoteliale progenitorceller (EPC'er) i det perifere blod hos voksne. Disse celler besidder evnen til at differentiere til modne endotelceller i kultur og menes at deltage i postnatal vaskulogenese. ^3,4

Protokoller til isolering og udvidelse af disse EPC'er involverer typisk kultur af perifere mononukleære celler (PBMNCs) i medier indeholdende endotelvækstfaktorer, herunder Vascular endotel vækstfaktor (VEGF) og fibroblastvækstfaktor-2. ^5-8 EPC kulturer producere en række dramatisk forskellige celletyper. Indledende kulturer (<7 dage) domineres af en monocytiske celletype, der er kendt i litteraturen som "tidlige" EPC'er. På trods af deres navn, disse celler udtrykker monocyt markør CD14, er negative for progenitor markør CD34 og kun udtrykker minimale niveauer af den klassiske endotel markører CD31 og VEGF receptor 2 (VEGFR2). ⁵ Fortsat kultur giver anledning til en sekundær cellepopulation, kendt som sene udvækst EPC'er eller blod udvækst endotelceller (BOECs), som vises som diskrete kolonier af endotel-lignende celler. I modsætning til de monocytiske tidlige EPCs, BOECs, som også er blevet kaldt endotelceller kolonidannende celler (ECFCs), udvækst endotelceller eller sent-udvækst endotelceller, udviser brosten morfologi, der er typisk for endotheliale cellemonolag og er meget ens i overflademarkør5 og genekspression ⁹ til modne endotelceller.

Dannelsen af endotelceller-lignende celler fra perifert blod giver flere fordele, især til undersøgelse af endotelcelle dysfunktion associeret med vaskulære lidelser, såsom pulmonal arteriel hypertension (PAH) ^{10 eller} von Willebrands sygdom. ^11. Forud for tilgængeligheden af BOECs, endotel- celler kunne kun udledes af eksplanterede organer på dødstidspunktet eller organtransplantation, eller isoleret fra navlestrengen vene ved fødslen. Denne reducerede tilgængelighed udgjorde en alvorlig begrænsning for forståelsen af ​​biologien af ​​endotelceller fra patienter med hjerte-kar-lidelser, samt samspillet mellem endotelceller og enten blodceller eller vægmaleri celler. Endvidere isolering og dyrkning af en ren population af endotelceller fra disse kilder er teknisk udfordrende og cellerne afledt ved disse fremgangsmåder udviser kun en begrænd proliferativ kapacitet. BOECs Derfor tilbyder en værdifuld surrogat for isolering og dyrkning af patient-afledte primære endotelceller.

Ud over deres in vitro applikationer, BOECs er også potentielt anvendelige autologe celletransplantation behandlinger. Disse anvendelser indbefatter både endotelcelle transplantation for at fremme neovaskularisering (se ¹² og referencer deri), samt genereringen af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). ¹³ BOEC-afledte iPSCs kan anvendes til sygdomsmodeller og tilbyde et stort potentiale som udgangspunkt materiale til autologe celleterapi. BOECs omprogrammere hurtigere og med en højere effektivitet end huden fibroblaster. Desuden BOECs også mulighed for generering af iPSCs der er fri for karyotypic abnormiteter, hvilket er et væsentligt element i enhver teknologi, der vil være egnet til translationelle applikationer. Evnen til at generere iPSCs fra en patientblodprøve enLSO eliminerer behovet for en hudbiopsi og generering af hudfibroblaster, hvilket letter genereringen af ​​celler fra patienter med sårheling lidelser eller de meget unge.

Protokollen beskrevet nedenfor, der er godkendt af og gennemføres i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Research Ethics service Komité (Øst), giver en enkel og pålidelig metode til generering af BOECs med mere end 90% effektivitet fra en relativt lille volumen (60 ml) i perifert blod. Disse celler er meget proliferativ og kan passeres gentagne gange, hvilket muliggør generering af hundreder af millioner af celler fra en enkelt prøve af blod.

Protocol

En skematisk afbildning af BOEC generation protokol er vist i figur 1. 1. Blodprøvetagning og densitetsgradientcentrifugering For hver donor tilsættes 3 ml natriumcitrat til hver af to 50 ml koniske centrifugerør. Saml 60 ml blod ved venepunktur, og der tilsættes 30 ml til hvert rør. Vend forsigtigt 2-3 gange for at blande. Brug så lidt som 40 ml blod i protokollen, med citrat justeret i overensstemmelse hermed mængder. BEMÆRK: Det er vigtigt, at blodprøver behandles inden 2 timer for indsamlingen. Forsinket behandling af blod resulterer i en markant reduktion i udvækst koloni udbytte. Udarbejde nye koniske rør indeholdende densitetsgradientcentrifugering medium ved først at vende flasken på hovedet adskillige gange for at blande. I en steril hætte, tilsættes 15 ml densitetsgradientcentrifugering medium pr 50 ml konisk rør (1 tube for hver 10 ml blod, 6 rør pr donor). Fortynd blodet 1: 1 med Dulbeccos Fosfat-Buffered Saline (DPBS). Vip røret med densitetsgradientcentrifugering medium til en vinkel på 20 ° med arbejdsfladen. Ved hjælp af en pipette støtte og en 25 ml serologisk pipette langsomt lag 21 ml fortyndet blod oven på mediet ved gradvis tilsætning blod ned væg vippet rør. BEMÆRK: Dette vil minimere blanding af blodet med densitetsgradient lag og vil producere en strammere buffy coat, samt en forbedret udbytte. Centrifugér prøver ved 400 xg i 35 minutter ved stuetemperatur med speederen og bremsen fra. I løbet af denne periode centrifugering, begynder kollagen coating beskrevet i trin 2.1 – 2.4. Sikre, at disse trin er gennemført, før du fortsætter til trin 3.1. 2. Collagen Belægning af T-75 kolbe og Udarbejdelse af Kultur Medium BEMÆRK: Udfør følgende trin i en cellekultur hætte. Forbered en 50 ug / ml collagen løsning ved at fortynde lager Type I collagen i 10 ml 0,02 M eddikesyre. Eksempel: for kollagen lager ved en koncentration på 4,05 mg / ml, tilsættes 123,5 pi kollagen til 10 ml 0,02 M eddikesyre. Sterilfilter collagen suspension før brug. Ved hjælp af en serologisk pipette tilsættes 7,5 ml collagen løsning på et T-75 cellekultur kolbe. Denne mængde giver 5 ug kollagen / cm2 (eller 375 pg / kolbe). Coat kolbe i 1 time ved stuetemperatur. Forbered endotel vækstmedium anvendes til BOEC generation ved at supplere endothelial basal medium med vækstfaktoren kosttilskud, som fabrikanten. Tilføj alle kosttilskud, men ikke tilføjer serum. Til fremstilling af 15 ml af BOEC generation medium tilsættes 2,5 ml defineret kalvefosterserum (FBS) til 12,5 ml endotelvækstfaktor medium indeholdende vækstfaktor kosttilskud. Fortsæt med trinene i afsnit 3. Efter belægningen perioden 1 time, aspireres kollagenopløsningen og vaske væk resterende eddikesyre ved pipetteringi 10 ml DPBS. Aspirer off DPBS og gentag dette vasketrin gang mere. Hvis cellen suspensionen opnået i trin 3.3 er ikke klar til udpladning på dette tidspunkt, tilsættes 5 ml BOEC generation medium til kolben for at holde kollagen belægning fra udtørring. 3. Indsamling og Plating af PBMNCs Efter densitetsgradientcentrifugering skitseret i trin 1.4, omhyggeligt indsamle buffy coat lag ved hjælp af en steril plastik transfer pipette. Samling af buffy coat bør give ca. 20 ml cellesuspension og plasma fra hvert rør. Undgå at overføre densitetsgradienten medium. Den mononukleære cellesuspensionen 1 Fortynd: 1 i DPBS og vend for at blande. Centrifugeres ved stuetemperatur i 20 minutter ved 300 xg med bremse og speeder på maksimum. Efter centrifugering aspireres supernatanten og resuspender cellerne ved tilsætning af 1 ml BOEC generation medium til hver pellet og at pipettere op og ned flere gange. Pool cellesuspensioner end påfyld samlet volumen til 10 ml med det resterende medium. For at få et skøn over den samlede celleantal, prøve 10 pi cellesuspension og fortyndes 50x med 490 pi Turk løsning, som vil lysere røde blodlegemer. Tæller en 10 pi prøve af den fortyndede cellesuspension anvendelse af et hæmocytometer. BEMÆRK: 60 ml af blod bør give cirka 100-150 x 10 6 hvide blodlegemer til plating. Plate hele cellesuspension i et enkelt, collagen-coatede T-75 kolbe top-up medium volumen til 15 ml / kolbe, og dyrkning ved 37 ° C i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2. Celler udpladet på dette tidspunkt repræsenterer passage 0. BEMÆRK: Det er muligt at fryse de isolerede PBMNCs forud for BOEC isolering med henblik på at udlede de BOECs på et senere tidspunkt eller for at transportere de PBMNCs til et andet laboratorium, hvor de BOECs kan genereres. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at frysningen PBMNCs kunne reducere effektiviteten af ​​BOEC isolation. See afsnit 8 nedenfor for metoden. 4. Langsigtet Cell Culture Skift medium hver 2 dage ved tilsætning af 15 ml frisk BOEC generation medium (5: 1 blanding af endothelial cellevækst medium og defineret FBS). For weekenden, kan blive forsinket medium ændringer hver 3 dage. BEMÆRK: udvækst kolonier skal vises mellem 7 og 14 dage kultur. Overvåg BOEC dyrkningskolbe på dag 7-14 til forekomsten af ​​udvækst kolonier. Identificer kolonier som cirkulære grupper af celler, der udviser et klassisk endotel brosten morfologi. Når en koloni eller flere kolonier identificeres i kolben, fortsæt med udskiftning af medium og tillade kolonier at vokse til ca. 1000 til 2000 celler pr koloni før passage. Bestem celle antal pr koloni gennem et groft visuel skøn. BEMÆRK: Som en vejledning, er det almindeligt at passage indledende udvækst kolonier En uge efter identifikationen af ​​den første udvækst koloni. <li> Passage celler ved skylning kolber to gange med 10 ml DPBS. Der tilsættes 5 ml 1X trypsin-EDTA og inkuberes i en 37 ° C inkubator i 5 minutter. Efter 5 minutter neutralisere trypsin med 10 ml medium (indeholdende FBS) og bringe celler i suspension ved gentagen pipettering. Centrifuge suspensionen ved 300 xg i 5 minutter, resuspenderes i 15 ml frisk BOEC generation medium og plade hele cellesuspension i en ny T-75 kolbe (der repræsenterer passagen 1, P1). Nr collagen belægning er nødvendig. Fortsæt udskiftning af medium som beskrevet ovenfor, indtil cellerne er sammenflydende (ca. 3-5 x 10 6 celler pr kolbe). Når sammenflydende, passage-celler som beskrevet i trin 4.3. BEMÆRK: Fra passagen 2 og fremefter, celler ikke længere kræver BOEC generation medium og kan dyrkes i endotelcellevækst medium og 10% standard varmeinaktiveret FBS. Kollagen belægning kan bruges som et valgfrit trin fremadrettet, da der er tegn på, at tilstedeværelsen af ​​kollagen kan forbedre BOEC proliferation satser. For fortsat passage, plade ikke færre end 750.000 celler pr T-75 kolbe så lave celledensiteter kan forårsage BOECs at stoppe prolifererende. 5. nedfrysning og optøning BOEC kulturer Trypsinisér celler som beskrevet i afsnit 4.3 og centrifuger ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender i 10 ml medium. Dette kræver ikke endothelcellevækst medium; DMEM med 10% FBS standard vil være tilstrækkelig. Saml en 10 pi prøve af cellesuspensionen til at udføre en manuel celletælling under anvendelse af et hæmocytometer. Centrifuge igen og resuspender på 2×10 6 celler / ml i iskoldt kryopræservering medium (40% DMEM med 50% FBS og 10% DMSO). Tilføj 0,5 ml (10 6 celler) til hvert hætteglas, sted hætteglas i en iskold isopropanol kryopræservering fartøj og sted i en -80 ° C fryser i mindst 2 timer før overførsel til flydende nitrogen. Efterlad ikke celler ved -80 ° C i mere end 24 timer. </li> Tø celler, tilsættes 10 ml foropvarmet medium til en 15 ml konisk centrifugerør. BEMÆRK: Når optøning passage 1-celler, optø i endotelcellevækst-medium suppleret med 20% FBS defineret for de første 2 dage efter optøning. Dette fører til en mere stabil celleisolering fremadrettet. Fjerne celler fra flydende nitrogen og optøning i et 37 ° C vandbad under forsigtig omrøring, indtil kun en lille iskrystal er tilbage i hætteglasset. Tilsæt indholdet af hætteglasset dråbevis til den koniske centrifugerør og spin ned ved 300 x g i 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml EGM-2MV + 10% FBS. Føj til T-75-kolbe og fyld medium til 15 ml. 6. Karakterisering af BOECs ved flowcytometri Når BOEC kolonier, der er beskrevet i afsnit 4 har fået lov til at udvide, Trypsinisér celler som beskrevet i afsnit 4.4 og resuspender i en koncentration på 10 6 celler pr ml i farvning buffer (DPBS with 2% FBS og 2 mM EDTA). Kombiner 10 5 celler med fluorokromkonjugerede antistoffer rettet mod CD45, CD14, CD34, CD31 (brug alle på 1:20 fortynding) eller VEGFR2 (fortyndet 1:10) (se tabel 1 for alle detaljer). Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C i mørke. Vask cellerne med 1 ml buffer og farvning centrifugeres ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender i 400 pi puffer farvning til analyse. At holde cellerne ved 4 ° C og beskyttet mod lys før analyse. Udfør cytometrisk analyse på et cytometer udstyret til at detektere fluorescens konjugerede antistoffer anvendt i assayet. Brug en ufarvet BOEC prøve at identificere cellepopulationen på cytometret ved at justere fremad og sidespredning spændinger, samt spændingerne for FITC og APC-kanaler. Bestem gating tærskler hjælp isotype farvede celler for hver fluorokrom. Vurdere positivitet for hver celleoverflademarkør baseret på presence af en top skift i fluorescensintensitet versus isotypekontrol for fluorochrom, der analyseres. 7. Karakterisering af BOECs af Immunfluorescerende Microscopy Plate BOECs i en 24-brønds, fladbundede vævskulturplade uden dækglas ved en densitet på 5 x 10 4 celler i 500 pi endotelcellevækst medium + 10% varmeinaktiveret FBS pr godt og lad til at klæbe og vokse ved 37 ° C ° C, 5% CO2, indtil celler omfatte mindst 70-80% af overfladearealet af hver brønd (skøn konfluens ved visuel inspektion under en let microsope). Vask cellerne i hver brønd i 5 minutter med 1 ml DPBS. Fix celler O / N ved 4 ° C med 500 pi 4% paraformaldehyd-opløsning i DPBS. Vask cellerne i 3 x 5 minutter med 1 ml DPBS per brønd. Tilføj og fjern DPBS ved hjælp af en pipette og en emhætte, hhv. Permeabilisere celler til 3 x 10 min med 0,2% polysorbat 20 i DPBS. </li> Cellerne inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i blokeringspuffer indeholdende 10% FBS i DPBS. Farv cellerne ved 4 ° CO / N i 300 pi antistof fortyndingsbuffer (0,1% bovint serumalbumin i DPBS) indeholdende primære antistoffer rettet mod CD34 (10 ug / ml), CD144 (1: 300) eller vWF (1: 250) . Se tabel 1 for alle detaljer. Vaske ubundne primære antistoffer til 5 x 10 min med DPBS. Cellerne inkuberes i 1 time ved stuetemperatur med det passende fluorescens-mærket sekundært antistof, som beskrevet i tabel 1 (alle på 1: 200). Vask ubundne sekundære antistoffer i 5 x 10 minutter med DPBS. Cellerne inkuberes med 1 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i DPBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne med DPBS yderligere 3 x 5 min. Billede celler ved 100x forstørrelse ved hjælp af et omvendt mikroskop udstyret med en ekstern lyskilde til fluorescens excitation og tage billeder ved hjælp af et vedhæfteed digitalkamera til efterfølgende analyse offline. 8. nedfrysning og optøning PBMNCs Ved afslutningen af ​​fase 3.2, efter centrifugering, aspireres mediet og manuelt forstyrre cellepelleten ved gentagen pipettering op og ned ved hjælp af en P1000 pipettespids. Tilsæt 1 ml af frysning medium, 90% serum og 10% DMSO, og sørg for at blande forsigtigt for at producere en celle suspension. Overfør cellesuspensionen til en kryohætteglas og fryse og tø, som beskrevet i afsnit 5.

Representative Results

Isolering af buffy coat mononukleære celler fra 60 ml blod giver typisk 100-150×10 6 totale hvide blodlegemer. Når udpladet i en enkelt T-75 kolbe, det store antal af celler i ulyserede cellesuspension gør det vanskeligt at løse individuelle vedhæftende celler ved hjælp af lysfeltmikroskopi. Gentagne medium ændringer resulterer i clearance af ikke-klæbende celler og give mulighed for visualisering af den vedhængende population af monocytisk "tidlige" EPC'er. På dag 7, vil den T-75 indeholder ca. 7×10 6 af disse langstrakte adhærente celler. Fra dag 7 til 14, bør kolonier af BOECs møde inden for den kolbe (figur 2A). Kolonier først vises som 3 til 5 tilstødende celler. Udvækst antallet af kolonier kan variere fra 1 til 10 kolonier pr 60 ml blod. Generelt yngre donorer (dvs. 20-25 år) har tendens til at frembringe et større antal udvækst kolonier, som også fremgår tidligere i kulturen.BOECs formere fra denne centrale gruppe af celler til at danne cirkulære kolonier bestående af flere hundrede celler. Celler i disse kolonier udviser en klassisk endotel brosten morfologi. Det foretrækkes at passage oprindelige kolonier når de indeholder cirka 1000 celler pr koloni. Udvækst kolonier typisk nå denne størrelse 7 dage efter deres oprindelige udseende i kultur. Når de oprindelige kolonier passeret i en ny T-75 kolbe, bør de prolifererer til dannelse af en konfluent monolag (3-5×10 6 celler pr kolbe) inden for 5 dage eller mindre (figur 2B). I en lille procentdel af isolationer (<10%), udvækst kolonier udebliver, eller ikke formere sig i tilstrækkelig grad følger denne indledende passage skridt. BOECs der udviser lav spredning efter deres første passage sjældent går videre til at blive stabile BOEC isolationer og ofte stoppe prolifererende inden for to til tre passager. Den monocytisketidlige EPCs indeholdt i BOEC kulturer er ikke-proliferative og er typisk fjernet fra kulturerne inden for 1-2 passager. Afslutning af disse tidlige celler skyldes celledød, svigt af de tidlige celler til at re-klæbe efter passage og fortynding af ikke-proliferative tidlige EPC'er med gentagen passage. Passage 1-celler kan enten være yderligere passage i kultur eller nedfrosset til senere brug. Når en stabil isolation genereres, kan cellerne passeres med en hastighed på 1 sammenflydende kolbe til 3-5 nye T-75 kolber indtil passagen 8 eller 9, før de bliver hvilende. Igen, celledensitet er kritisk i hele kulturen. Det er vores erfaring, bør ikke færre end 750.000 celler forgyldt i en T-75 kolbe, som lavere celletætheder kan forårsage vækst anholdelse. Trods af den høje proliferative potentiale BOECs, celler bør heller ikke lov til at blive overconfluent (dvs..,> 5×10 6 celler pr kolbe), da dette kan medføre samtaler ion BOECs til en ikke-proliferativ fænotype. Vi foreslår, at enhver celle blive stemplet som en BOEC skal vise passende celleoverfladen og intracellulær farvning for endotel markører. Karakterisering af BOECs kan opnås ved hjælp af flowcytometri (figur 3) eller fluorescensmikroskopi (Figur 4), efter farvning for typiske endotelceller cellemarkører. BOECs er positive for endotel overflademarkører CD31 og VEGFR2 og er negativ for monocyt markør CD14 og den pan-leukocyt markør CD45. BOECs beskyttelsesbehov også Weibel-Palade organer og dermed udtrykker Von Willebrand Faktor (vWF) som diskrete, punktformet cytoplasmatisk farvning. I modsætning til andre modne endotelceller celletyper, såsom pulmonal eller aortaendotelceller, BOECs udtrykker også stamfader og aktivering markering CD34 på deres overflade. ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/> Figur 1. Skematisk diagram af BOEC generation protokol. Perifere mononukleære blodceller isoleres fra veneblod ved densitetsgradientcentrifugering og dyrket på collagen-coatede plader i endotel vækstmedium indeholdende defineret FBS. BOEC kolonier vises inden for 7-14 dage efter kultur. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2. Lysfelt billeder af repræsentative BOEC kulturer. (A) udvækst kolonier vises i kulturer mellem dag 7 og 14. Kolonier stede som samlinger af endotelceller-lignende celler, som er arrangeret i en brosten monolag og prolifererer radialt ud fra et centralt punkt. Omkring udvækst kolonier er de vedhængende monocytic celler, der udgør langt størstedelen af ​​celler i de tidlige kulturer. Disse celler, der tidligere er beskrevet som "tidligt" endoteliale progenitorceller har en spindel-lignende morfologi og udtrykke monocytiske markør CD14. (B) Efter passage, de stærkt proliferative BOECs overtage kulturer, som de ikke-proliferative monocytceller enten dø eller undlader at re-vedhæfte efter passage. Målestok 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3. Karakterisering af BOECs ved flowcytometri. BOECs blev trypsiniseret og farvet med fluorescens-konjugerede isotypekontrolantistoffer (grå fyldt peak) eller antistoffer rettet mod specifikke overflademarkører (rød linje). Overflademarkører til cytometrisk karakteriseringomfatter de hæmatopoietiske markører CD45 og CD14, de endotel markører CD31 og VEGFR2 og progentior og endotel aktivering markør CD34. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4. immunfluorescensfarvning af BOECs for endotheliale cellemarkører. Repræsentative immunofluorescens billeder af BOECs immunfarvet med antistoffer rettet mod endotelcelleoverfladen markør CD144 (VE-cadherin, øverst til højre panel) og blodet glycoprotein von Willebrand Factor (vWF, nederst til højre panel) . Tilsvarende paneler viser nukleare DAPI farvning er vist til venstre. Scale bar 50 pm. til CD144. Klik her for at se et størreversion af denne figur.

Discussion

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.^14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.

Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.

Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.¹³ This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Materials

For blood collection
60 mL syringe with luer-lok tip	BD	309653
19G Surflo Winged Infusion Set	Terumo	SV-19BL
50 mL conical centrifuge tube	StarLab	E1450	2 per donor
Sodium Citrate	Martindale Pharmaceuticals	270541
Name	Company	Catalog Number	Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes	Appleton Woods	KC231
Turk’s Solution	Millipore	1.093E+09
Name	Company	Catalog Number	Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail)	BD Biosciences	35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
0.02M Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283	prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum)	Lonza	CC-3202	Note: It is essential that the medium does not contain heparin.   Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined	Hyclone	SH30070
10x Trypsin EDTA	Gibco	T4174	Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS	Gibco	10500-064
DMEM	Gibco	41965-039
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Sigma-Aldrich	C1562
Name	Company	Catalog Number	Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14	BD Biosciences	555397	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31	BD Biosciences	555445	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34	BD Biosciences	555824	Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45	BD Biosciences	560976	Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2	R&D Systems	FAB357A	Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555748	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555751	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	R&D Systems	IC002A Dilution: 1:10	Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution	Sigma-Aldrich	E7889
Name	Company	Catalog Number	Comments
For immunofluorescent microscopy
Corning Costar 24-well tissue culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody	R&D Systems	MAB72271	Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)	R&D Systems	AF938	Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)	Abcam	ab154193	Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21202	Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11055	Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate	Life Technologies	A-10042	Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542	use at 1 μg/ml