Generation och kultur of Blood utväxt endotelceller från humant perifert blod

Summary

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Abstract

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Introduction

Tills nyligen var den postnatal generering av nya blodkärl tros ske enbart genom en process som kallas angiogenes, definierad som groning av nya fartyg från endotelcellerna av befintliga fartyg. ¹ Denna process kontrast från vaskulogenes, eller bildandet de novo av blodkärl från endotel progenitorceller, som var tänkt att ske enbart under fosterutvecklingen. ² har dock nyare studier identifieras och isoleras cirkulerande endotelceller progenitorceller (EPC) i det perifera blodet hos vuxna. Dessa celler har kapaciteten att differentiera till mogna endoteliala celler i odling och tros delta i postnatal vaskulogenes. ^3,4

Protokoll för isolering och expansion av dessa EPC inbegriper typiskt kulturen av perifera blodmononukleära celler (PBMNCs) i media som innehåller endoteliala tillväxtfaktorer, inklusive vascular endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och fibroblasttillväxtfaktor-2. ^5-8 EPC kulturer producera en mängd dramatiskt olika celltyper. Inledande kulturer (<7 dagar) domineras av en monocytisk celltyp, känd i litteraturen som "tidiga" EPC. Trots sitt namn, dessa celler uttrycker monocyten markören CD14, är negativa för stamfader markören CD34 och uttrycker endast minimala nivåer av klassiska endoteliala markörerna CD31 och VEGF-receptor 2 (VEGFR2). ⁵ Fortsatt kultur ger upphov till en sekundär population av celler, kallas sent utväxt EPC eller blod utväxt endotelceller (BOECs), som visas som diskreta kolonier av endotelceller liknande celler. Till skillnad från de monocytiska tidiga EPC, BOECs, som också har kallats endotelceller kolonibildande celler (ECFCs), utväxt endotelceller eller sena utväxt endotelceller, uppvisar kullersten morfologi som är typiskt för endotelceller cellmonoskikt och är mycket lika i ytmarkör5 och genuttryck ⁹ till mogna endotelceller.

Genereringen av endotelceller-liknande celler från perifert blod ger flera fördelar, särskilt för studiet av endotelceller dysfunktion i samband med vaskulära sjukdomar såsom pulmonell arteriell hypertension (PAH) ¹⁰ eller von Willebrands sjukdom. ¹¹ Innan tillgången på BOECs, endotel celler kunde bara komma från explanterade organ vid tidpunkten för dödsfallet eller organtransplantation, eller isoleras från navelsträngsvenen vid födseln. Denna reducerade tillgänglighet representerade en allvarlig begränsning för att förstå biologin av endotelceller från patienter med kardiovaskulära sjukdomar, liksom samspelet mellan endotelceller och antingen blodkroppar eller väggceller. Dessutom är tekniskt utmanande isolering och odling av en ren population av endotelceller från dessa källor och celler härledda av dessa metoder uppvisar endast en limited fortplantningsförmågan. BOECs erbjuder därför ett värdefullt surrogat för isolering och odling av patientgenererade primära endotelceller.

Förutom deras in vitro-applikationer, BOECs är också potentiellt användbara vid autologa celltransplantationsterapier. Dessa applikationer innefattar både endotel celltransplantation för att främja neovaskularisation (se ¹² och referenser däri), samt generering av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). ¹³ BOEC-härledda iPSCs kan användas för sjukdomsmodellering och erbjuder enorma potential som start material för autologa cellterapier. BOECs programmera snabbare och med en högre verkningsgrad än hudfibroblaster. Dessutom BOECs tillåter också för generering av iPSCs som är fria från karyotypic avvikelser, vilket är ett viktigt inslag i all teknik som kommer att vara lämpliga för translationella applikationer. Förmågan att generera iPSCs från en patient blodprov aLSO eliminerar behovet av en hudbiopsi och generering av hudfibroblaster och därigenom underlätta genereringen av celler från patienter med sårläkningsstörningar, eller mycket unga.

Protokollet beskrivs nedan, godkänts av och genomföras i enlighet med riktlinjerna i National Research Ethics servicekommittén (East of England), erbjuder en enkel och tillförlitlig metod för generering av BOECs med mer än 90% effektivitet från en relativt liten volym (60 ml) av perifert blod. Dessa celler är mycket proliferativ och kan passeras flera gånger, vilket möjliggör generering av hundratals miljoner celler från en enda blodprov.

Protocol

En schematisk bild av BOEC generationen protokoll visas i fig 1. 1. Blod Insamling och densitetsgradientcentrifugering För varje givare, tillsätt 3 ml natriumcitrat till vardera av två 50 ml koniska centrifugrör. Samla 60 ml blod genom venpunktion och tillsätt 30 ml till varje rör. Vänd försiktigt 2-3 gånger för att blanda. Använd så lite som 40 ml blod i protokollet, med citrat volymer justeras i enlighet med detta. OBS: Det är viktigt att blodprover bearbetas inom 2 timmar för insamlingen. Fördröjd behandling av blodresulterar i en markant minskning av utväxt koloni utbyte. Förbered nya koniska rör innehållande densitetsgradientcentrifugering mediet genom att först vända flaskan flera gånger för att blandas. I en steril huv, tillsätt 15 ml densitetsgradientcentrifugering medium per 50 ml koniskt rör (1 rör för varje 10 ml blod, 6 rör per donator). Späd blod 1: 1 med Dulbeccos fosfatbuffrade-Buffered Saltlösning (DPBS). Luta röret med densitetsgradientcentrifugering medium till en vinkel av 20 ° med arbetsytan. Med användning av en pipett stöd och en 25 ml serologisk pipett, långsamt skiktet 21 ml utspätt blod ovanpå mediet genom gradvis tillsats av blod ned väggen i det tippade röret. OBS: Om du gör det kommer att minimera blandning av blodet med densitetsgradient skiktet och kommer att producera en snävare buffy coat, liksom ett förhöjt utbyte. Centrifugera proverna vid 400 xg under 35 min vid RT med gaspedalen och bromsen av. Under denna period centrifugeringen börjar kollagen beläggning beskrivs i steg 2.1 – 2.4. Säkerställa att dessa åtgärder har genomförts innan du fortsätter med steg 3.1. 2. Kollagen Beläggning av T-75 kolv och Beredning av odlingsmedium OBS: Utför följande steg i en cellkultur huva. Bered en 50 | ig / ml kollagenlösning genom att späda lager Type I-kollagen i 10 ml 0,02 M ättiksyra. Exempel: för kollagen lager vid en koncentration av 4,05 mg / ml, tillsätt 123,5 mikroliter av kollagen för att 10 ml 0,02 M ättiksyra. Sterilfiltrera kollagensuspension före användning. Med användning av en serologisk pipett, tillsätt 7,5 ml av kollagenlösning till en T-75 cellkulturkolv. Denna volym ger 5 pg kollagen / cm 2 (eller 375 | ig / kolv). Coat kolv under en timme vid RT. Förbered endoteliala tillväxtmediet som används för BOEC generationen genom att komplettera endotel basmedium med tillväxtfaktor tillskott som tillhandahålls av tillverkaren. Lägg till alla tillägg, men inte lägga serum. För framställning av 15 ml BOEC generationens mediet, tillsätt 2,5 ml definierat fetalt bovint serum (FBS) till 12,5 ml endotelial tillväxtmedium innehållande tillväxtfaktor tillskott. Fortsätt med stegen i avsnitt 3. Efter 1 timme beläggningsperiod, aspirera kollagenlösningen och tvätta bort kvarvarande ättiksyra genom pipetteringi 10 ml DPBS. Sug bort DPBS och upprepa detta tvättsteg en gång. Om cellsuspensionen erhållits under steg 3.3 är inte redo för plätering vid denna tid, tillsätt 5 ml BOEC generation medium till flaskan för att hålla kollagen beläggning från uttorkning. 3. Insamling och plätering av PBMNCs Efter densitetsgradientcentrifugering beskrivs i steg 1,4, noggrant samla koncentratskiktet med användning av en steril plast överföringspipett. Insamling av lättcellskoncentratet bör ge ca 20 ml cellsuspension och plasma från varje rör. Undvik att överföra densitetsgradienten mediet. Späd den mononukleära cellsuspension 1: 1 i DPBS och invertera att blanda. Centrifugera vid RT i 20 min vid 300 x g med broms och gaspedal vid maximal. Efter centrifugering, aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna genom att tillsätta 1 ml BOEC generationens medium till varje pellet och pipettera upp och ned flera gånger. Pool cellsuspensioner ettd fyll totala volymen till 10 ml med det återstående mediet. För att få en uppskattning av totala cellantalet, prov 10 | il cellsuspension och späd 50x med 490 | il av Turks lösning, som kommer lysera röda blodkroppar. Räkna ett prov av den utspädda cellsuspensionen med användning av en hemocytometer 10 | il. OBS: 60 ml blod bör ge cirka 100-150 x 10 6 vita blodkroppar för plätering. Tavla hela cellsuspension i en enda, kollagen-belagda T-75-kolv, top-up medelhög volym till 15 ml / kolv och odling vid 37 ° C i en fuktad atmosfär innehållande 5% CO2. Celler pläterade vid denna tidpunkt representerar passage 0. OBS: Det är möjligt att frysa de isolerade PBMNCs före BOEC isolering för att härleda BOECs vid ett senare tillfälle eller för att transportera PBMNCs till ett annat laboratorium där kan genererat BOECs. Det är emellertid viktigt att notera att frysning PBMNCs skulle kunna minska effektiviteten hos BOEC isolering. See punkt 8 nedan för metod. 4. Långsiktig Cell Culture Byt medium var 2 dagar genom tillsats av 15 ml färskt BOEC generations-medium (5: 1 blandning av endotelcelltillväxt medium och definierat FBS). För helger, kan medel förändringar försenas till varje 3 dagar. OBS: utväxt kolonier ska visas mellan 7 och 14 dagars odling. Övervaka BOEC odlingskolv på dagarna 7-14 för uppkomsten av utväxt kolonier. Identifiera kolonier som cirkulära grupper av celler som uppvisar en klassisk endotel kullersten morfologi. När en koloni eller flera kolonier identifieras i kolven, fortsätt med medel förändringar och tillåta kolonier växa till ungefär 1000 till 2000 celler per koloni före passage. Bestäm mobilnummer per koloni genom en grov visuell uppskattning. OBS: Som en vägledning, är det brukligt att passage initiala utväxt kolonier en vecka efter fastställandet av den första utväxt kolonin. <li> Passage celler genom att skölja flaskor två gånger med 10 ml DPBS. Tillsätt 5 ml 1X trypsin-EDTA och inkubera i ett 37 ° C inkubator under 5 min. Efter 5 minuter, neutralisera trypsin med 10 ml medium (innehållande FBS) och ta celler i suspension med upprepad pipettering. Centrifugera suspensionen vid 300 xg under 5 minuter, återsuspendera i 15 ml färskt BOEC generationens mediet och plattan hela cellsuspension i en ny T-75-kolv (representerande passagen 1, P1). Ingen kollagen beläggning krävs. Fortsätt medel ändringarna som beskrivs ovan tills cellerna är sammanflytande (ca 3-5 x 10 6 celler per flaska). När sammanflytande, passage celler såsom beskrivits i steg 4.3. Anmärkning Från passagen 2 och framåt, celler inte längre kräver BOEC generationens medium och kan odlas i endotelceller tillväxtmedium och 10% standardvärmeinaktiverat FBS. Kollagen beläggning kan användas som ett valfritt steg framåt, eftersom det finns tecken som tyder på att närvaron av kollagen kan förbättra BOEC proliferation priser. För fortsatt passage, plåt inte mindre än 750.000 celler per T-75 kolv så låga celltätheter kan orsaka BOECs att sluta frodas. 5. Frysning och upptining BOEC kulturer Trypsinize celler som beskrivs i avsnitt 4.3 och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera i 10 ml medium. Detta kräver inte endotelcelltillväxt medium; DMEM med 10% standard FBS kommer att vara tillräcklig. Samla ett prov av cellsuspensionen 10 ul för att utföra en manuell cellräkning med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera igen och återsuspendera vid 2×10 6 celler / ml i iskall frysförvaring medium (40% DMEM med 50% FBS och 10% DMSO). Tillsätt 0,5 ml (10 6 celler) till varje flaska, placera flaskor i en iskall isopropanol frysförvaring kärl och häll i en -80 ° C frys under minst två timmar innan de överförs till flytande kväve. Lämna inte celler vid -80 ° C i mer än 24 timmar. </li> Tina celler, tillsätt 10 ml av förvärmda mediet till en 15 ml koniskt centrifugrör. OBS: När upptining ut passage 1-celler, tina i endotelceller tillväxtmedium kompletterat med 20% definieras FBS för de första 2 dagar efter upptining. Detta leder till en mer stabil cellisolering framöver. Avlägsna celler från flytande kväve och tining i ett 37 ° C vattenbad med försiktig omröring tills endast en liten iskristall är kvar i injektionsflaskan. Tillsätt innehållet i injektionsflaskan droppvis till den koniskt centrifugrör och centrifugera ner vid 300 xg under 5 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml EGM-2mV + 10% FBS. Lägg till T-75-kolv och fyll på medellång till 15 ml. 6. Karakterisering av BOECs med flödescytometri När BOEC kolonierna som beskrivs i avsnitt 4 har tillåtits expandera, trypsinize celler som beskrivs i avsnitt 4.4 och resuspendera vid en koncentration av 10 6 celler per ml i färgningsbuffert (DPBS with 2% FBS och 2 mM EDTA). Kombinera 10 5 celler med fluorokromkonjugerade antikroppar riktade mot CD45, CD14, CD34, CD31 (använd alla vid 1:20 utspädning) eller VEGFR2 (utspädd 1:10) (se tabell 1 för fullständig information). Inkubera under 30 minuter vid 4 ° C i mörker. Tvätta cellerna med 1 ml färgningsbuffert och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera i 400 ul färgning buffert för analys. Håll celler vid 4 ° C och skyddas från ljus före analys. Utför cytometrisk analys på en flödescytometer utrustad att detektera de fluorescerande konjugerade antikroppar som används vid analysen. Använd en ofärgade BOEC prov för att identifiera cellpopulationen på cytometern genom att justera framåt- och sidospridningsspänningar, samt spänningarna för de FITC- och APC-kanaler. Bestäm grind tröskelvärden använder isotyp färgade celler för varje fluorokrom. Bedöm positivitet för varje cellytemarkör baserad på presence av en topp skift i fluorescensintensitet som funktion av isotypkontroll för fluorokromen som analyseras. 7. Karakterisering av BOECs genom immunfluorescensmikroskopi Plate BOECs i en 24-brunnars, flatbottnad vävnadsodlingsplatta utan täckglas vid en densitet av 5 x 10 4 celler i 500 pl av endotelcelltillväxt-medium + 10% värmeinaktiverat FBS per brunn och låt vidhäfta och växa i 37 ° C, 5% CO2 tills cellerna täcker åtminstone 70-80% av ytarean hos varje brunn (uppskattning konfluens genom visuell inspektion under ett ljus microsope). Tvätta celler i varje brunn under 5 min med 1 ml DPBS. Fix celler O / N vid 4 ° C med 500 ul av 4% paraformaldehydlösning i DPBS. Tvätta celler för 3 x 5 min med 1 ml DPBS per brunn. Lägg till och ta bort DPBS med hjälp av en pipett och en suganordning, respektive. Permeabilize celler för 3 x 10 min med 0,2% polysorbat 20 i DPBS. </li> Inkubera cellerna under 1 h vid RT i blockeringsbuffert innehållande 10% FBS i DPBS. Fläcken celler vid 4 ° CO / N på 300 pl utspädningsantikroppsbuffert (0,1% bovint serumalbumin i DPBS) innehållande primära antikroppar riktade mot CD34 (10 | ig / ml), CD144 (1: 300) eller vWF (1: 250) . Se tabell 1 för fullständig information. Tvätta obundna primära antikroppar för 5 x 10 min med DPBS. Inkubera cellerna under 1 h vid RT med den lämpliga fluorescensmärkt sekundär antikropp, såsom beskrivs i tabell 1 (samtliga vid 1: 200). Tvätta obundna sekundära antikroppar för 5 x 10 min med DPBS. Inkubera cellerna med 1 | ig / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i DPBS för 10 min vid RT. Tvätta cellerna med DPBS under ytterligare 3 x 5 min. Bild celler vid 100 gångers förstoring med hjälp av ett inverterat mikroskop utrustat med en extern ljuskälla för fluorescensexcitation, och ta bilder med hjälp av en fästaed digitalkamera för efterföljande analys offline. 8. nedfrysning och upptining PBMNCs Vid slutet av steg 3,2, efter centrifugering, aspirera mediet och manuellt störa cellpelleten med upprepad pipettering upp och ned med hjälp av en P1000 pipettspetsen. Tillsätt 1 ml frysmedium, 90% serum och 10% DMSO, och se till att blanda försiktigt för att framställa en cellsuspension. Överför cellsuspensionen till en cryovial och frysa och tina som beskrivs i avsnitt 5.

Representative Results

Isolering av buffy coat mononukleära celler från 60 ml blod ger typiskt 100-150×10 6 totala antalet vita blodkroppar. När pläterades till en enda T-75-kolv, det stora antalet celler i olyserade cellsuspensionen gör det svårt att lösa enskilda vidhäftande celler med hjälp av bright mikroskopi. Upprepade medel förändringar resulterar i avslutandet av icke-vidhäftande celler och möjliggöra visualisering av vidhäftande populationen av monocytisk "tidiga" EPC. Vid dag 7, kommer T-75 innehåller cirka 7×10 6 av dessa långsträckta vidhäftande celler. Från dag 7 till 14, bör kolonier av BOECs visas inom kolven (Figur 2A). Kolonier visas först som 3 till 5 angränsande celler. Utväxt koloniantal kan variera från 1 till 10 kolonier per 60 ml blod. I allmänhet yngre donatorer (dvs., 20-25 år gammal) tenderar att producera ett större antal utväxt kolonier, som också förekommer tidigare i kulturen.BOECs föröka från detta centrala grupp av celler för att bilda cirkulära kolonier som består av flera hundra celler. Celler inom dessa kolonier uppvisar en klassisk endotelial gatsten morfologi. Det är föredraget att passagen initiala kolonier när de innehåller cirka 1000 celler per koloni. Utväxt kolonier når typiskt denna storlek 7 dagar efter sitt ursprungliga utseende i kultur. När de ursprungliga kolonier passe till en ny T-75-kolv, bör de prolifererar för att bilda ett sammanflytande monoskikt (3-5×10 6 celler per kolv) inom 5 dagar eller mindre (figur 2b). I en liten andel av isolering (<10%), utväxt kolonier uteblir, eller inte föröka tillräckligt efter detta första passage steg. BOECs som uppvisar låg proliferation efter deras första passage går sällan på att bli stabila BOEC isoleringar och ofta slutar sprider inom två till tre passager. Den monocytiskatidiga EPC som finns i de BOEC kulturer är icke-proliferativ och är vanligtvis bort från kulturerna inom 1-2 passager. Avslut av dessa tidiga celler beror på celldöd, fel i de tidiga cellerna att åter följa efter passage och utspädning av icke-proliferativa tidiga EPC med upprepad passage. Passage 1 celler kan antingen passera ytterligare i kultur eller frysas ned för senare användning. När en stabil isolering alstras kan celler passe med en hastighet av en konfluent kolv till 3-5 nya T-75-kolvar fram till passagen 8 eller 9 för passande vilande. Återigen, är celldensitet kritisk hela kulturen. I vår erfarenhet, bör inte mindre än 750.000 celler vara klädd i en T-75 kolv, som lägre celltätheter kan orsaka tillväxthämning. Trots den höga proliferativa potentialen hos BOECs celler bör inte tillåtas att bli overconfluent (ie.,> 5×10 6 celler per flaska) eftersom detta kan orsaka convers jonen av BOECs till en icke-proliferativ fenotyp. Vi föreslår att varje cell att stämplas som en BOEC ska visa lämplig cellytan och intracellulär färgning för endotelceller markörer. Karakterisering av BOECs kan åstadkommas genom flödescytometri (Figur 3) eller fluorescensmikroskopi (figur 4), efter färgning för typiska endoteliala cellmarkörerna. BOECs är positiva för endoteliala ytmarkörer CD31 och VEGFR2 och är negativt för monocyt markören CD14 och pan-leukocyt markör CD45. BOECs besitter också Weibel-Palade kroppar och sålunda uttrycka von Willebrand-faktor (vWF) som diskreta, punktuell cytoplasmisk färgning. Till skillnad från andra mogna endotelceller celltyper, såsom lungartären eller aortaendotelceller, BOECs uttrycker också föregångare och aktiveringsmarkören CD34 på sin yta. ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/> Figur 1. Schematiskt diagram av BOEC generations protokoll. Perifera mononukleära blodkroppar isoleras från venöst blod genom densitetsgradientcentrifugering och odlades på kollagenbelagda plattor i endotelial tillväxtmedium innehållande definierade FBS. BOEC kolonier visas inom 7-14 dagars odling. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2. Brightfield bilder av representativa BOEC kulturer. (A) utväxt kolonier visas i kulturer mellan dagarna 7 och 14. Kolonier närvarande som samlingar av endotelceller liknande celler, vilka är anordnade i en kullerstensmonoskikt och föröka sig radiellt ut från en central punkt. Omger utväxt kolonierna är vidhäftande monocytic celler som utgör den stora majoriteten av celler i tidiga kulturer. Dessa celler, som tidigare beskrivits som "tidiga" endotelceller progenitorceller, har en spindel-liknande morfologi och uttrycka monocytiska markören CD14. (B) Efter passage, de mycket proliferativa BOECs tar över kulturer, enligt icke-proliferativa monocytiska celler antingen dör eller inte åter fästa efter passage. Skala bar 250 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3. Karakterisering av BOECs genom flödescytometri. BOECs trypsinerades och färgades med fluorescerande-konjugerade isotyp kontrollantikroppar (grå fylld topp) eller antikroppar riktade mot specifika ytmarkörer (röd). Ytmarkörer för cytometrisk karakteriseringinkluderar de hematopoietiska markörerna CD45 och CD14, endotel markörer CD31 och VEGFR2 och progentior och endotel aktiveringsmarkör CD34. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4. Immunofluorescens färgning av BOECs för endoteliala cellmarkörerna. Representativa immunofluorescens bilder av BOECs immunostained med antikroppar riktade mot endotelial cellytemarkör CD144 (VE-cadherin, övre högra panelen) och blodet glykoprotein von Willebrand-faktor (vWF, nedre högra panel) . Motsvarande paneler som visar nukleär DAPI färgning visas till vänster. Skalstreck 50 | im. för CD144. Klicka här för att se en störreversion av denna figur.

Discussion

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.^14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.

Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.

Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.¹³ This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Materials

For blood collection
60 mL syringe with luer-lok tip	BD	309653
19G Surflo Winged Infusion Set	Terumo	SV-19BL
50 mL conical centrifuge tube	StarLab	E1450	2 per donor
Sodium Citrate	Martindale Pharmaceuticals	270541
Name	Company	Catalog Number	Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes	Appleton Woods	KC231
Turk’s Solution	Millipore	1.093E+09
Name	Company	Catalog Number	Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail)	BD Biosciences	35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
0.02M Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283	prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum)	Lonza	CC-3202	Note: It is essential that the medium does not contain heparin.   Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined	Hyclone	SH30070
10x Trypsin EDTA	Gibco	T4174	Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS	Gibco	10500-064
DMEM	Gibco	41965-039
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Sigma-Aldrich	C1562
Name	Company	Catalog Number	Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14	BD Biosciences	555397	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31	BD Biosciences	555445	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34	BD Biosciences	555824	Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45	BD Biosciences	560976	Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2	R&D Systems	FAB357A	Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555748	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555751	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	R&D Systems	IC002A Dilution: 1:10	Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution	Sigma-Aldrich	E7889
Name	Company	Catalog Number	Comments
For immunofluorescent microscopy
Corning Costar 24-well tissue culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody	R&D Systems	MAB72271	Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)	R&D Systems	AF938	Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)	Abcam	ab154193	Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21202	Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11055	Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate	Life Technologies	A-10042	Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542	use at 1 μg/ml