Mess physiologischen Reaktionen von<em> Drosophila</emNeurone> Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
Im Gegensatz zu Säugetieren, Insekten wie Drosophila haben mehrere Geschmacksorgane. Die chemosensorische Neuronen an den Beinen, Rüssel, Flügel und ovipositor von Drosophila exprimieren Geschmacks- Rezeptoren 1,2, Ionenkanäle 3-6 und ionotropen Rezeptoren 7 , die bei der Erkennung von flüchtigen und nichtflüchtigen sensorischen Signale beteiligt sind. Diese Neuronen direkt tastants Kontakt wie Lebensmittel, Schadstoffe und Pheromone und daher beeinflussen viele komplexe Verhaltensweisen wie Fütterung, Eiablage und Paarung. Elektrodenaufzeichnungen und Kalzium-Imaging wurden in Insekten zu quantifizieren, die neuronalen Reaktionen hervorgerufen durch diese tastants weit verbreitet. Allerdings erfordert die Elektrospezialausrüstung und um Messungen von einem einzigen Geschmack Sensillum kann technisch schwierig sein, je nach Zelltyp, Größe und Position. Darüber hinaus können einzelne Neuron Auflösung in Drosophila schwierig sein , da Geschmack sensilla hou zu erreichense mehr als eine Art von chemosensorische Neuronen. Die Live-Kalzium-Imaging hier beschriebene Methode erlaubt Antworten einzelner Geschmacks- Neuronen im Live-Fliegen gemessen werden. Dieses Verfahren ist besonders geeignet zum Abbilden neuronaler Antworten auf Lipid Pheromone und andere Liganden-Typen, die eine geringe Löslichkeit in Wasser basierende Lösungsmittel haben.
Introduction
Tiere verlassen sich auf Geruchs- und Geschmacks Informationen Entscheidungen zu vermitteln, von wesentlicher Bedeutung für das Überleben und die Fortpflanzung. Zu verstehen , wie chemosensory cues werden erkannt und durch das Nervensystem verarbeitet erfordert die Identifizierung des sensorischen Rezeptor (en) und die entsprechenden chemischen Liganden. Drosophila eine erstaunliche Vielzahl von flüchtigen und nicht-flüchtigen Verbindungen erkennen und sind ein ausgezeichnetes Modell , bei dem die physiologische Studie Mechanismen der Chemosensorik. Während die Geruchsorgane flüchtige Moleküle wahrnehmen, werden die Geschmacks- Organe spezialisiert geringe Flüchtigkeit Verbindungen zu erkennen. Hier präsentieren wir eine Methode zur direkten neuronalen Antworten von den Geschmacksorgane von Drosophila melanogaster zu schwerflüchtige lipophile Liganden messen.
Gustatory Organe der Fliege sind die Vorderbeine, Rüssel und Flügel. Verteilt auf der Oberfläche der Geschmacksorgane sind haarähnliche Strukturen als sensilla bekannt, die auf s antwortenugars, Bitters, Salze, Wasser und Pheromone 8. Die sensilla wurden morphologisch in Geschmack Borsten klassifiziert und Geschmack Heringe 9. Es gibt etwa 31 Geschmack Borsten auf dem Labellum, die in den langen (L-Typ) klassifiziert sind, kurz (s-Typ) und Zwischenprodukt (i-Typ) Morphologien. Die 'l' und 's' sensilla Haus 4 sensorischen Neuronen , die physiologisch zu Zucker (der S – Zelle), wenig Salz (das L1 – Zelle), hohe Salz und Bitterstoffe (die L2 – Zelle) und Wasser (die W – Zelle) 10 antworten , 11. Die "i" sensilla Haus 2 sensorischen Neuronen, von denen 12 sowohl zu niedrigen Salz und Zucker, während die anderen reagiert auf hohe Salz reagiert. Es gibt etwa 41 Geschmack sensilla bei Männern und 26 bei Frauen sensilla auf jeder der Vorderbeine verteilt. Für Männer und Frauen gibt es 21 sensilla auf dem midleg, und etwa 22 sensilla auf dem Hinterbein 13. Die geschmackliche Neuronen durch den Geschmack sensilla auf den Beinen eingeschlossen sind auch classified in L1, L2, W und S-Typen.
Ein Standardverfahren zur Messung der elektrischen Aktivität von einzelnen Neuronen verwendet extrazelluläre oder intrazelluläre Elektroden Ionenstrom zu erfassen. Elektrodenmessungen erlauben neuronale Funktion in nicht-Modellorganismen wie Drosophila – Arten, Motten und Bienen , die umfangreiche genetische Werkzeuge für neuronale Kennzeichnung fehlt untersucht werden. Routinemäßig verwendet haben , jedoch während elektrophysiologischen Methoden wurden Aktivität von Drosophila Geschmack sensilla 4,13,14 zu messen, dieser Ansatz zugrunde gelegt stellt einige technische Herausforderungen. Zuerst schmecken Borsten identifiziert werden müssen, basierend auf der Morphologie und der räumlichen Lage. Bei der Identifizierung kann elektrophysiologische Messungen durch die geringe Größe des sensilla behindert werden, begrenzt Zugänglichkeit durch Position und Schwierigkeiten bei der Anwendung von kontrollierten Mengen eines chemischen Stimulus zu einem Geschmack Borste. Auch die Stimulation von sensilla erzeugen kann Signale von mehr als einerneuronale Typ 15. Zweitens Detektion elektrischer Signale kann durch Hintergrundrauschen verwechselt werden, die aus mechanischen Schwingungen und Geräusche von der elektronischen Ausrüstung. Drittens kann die Verwendung eines geschärften Elektrode , die Fliege Vorbereitung beschädigen, wenn sie falsch 14 verwendet. Schließlich erfordert eine Elektro Rig Montage spezialisierten elektronischen Komponenten für Stimulus Lieferung, Signalaufzeichnung und Datenanalyse und kann teuer werden.
In D. melanogaster, hat die Verfügbarkeit von genetisch-codierten Werkzeuge , um die Entwicklung von Bildgebungstechniken erleichtert , dass die Antworten von kleinen Populationen von Neuronen ermöglichen sucht werden. Ein solcher Ansatz ist die Verwendung des CaLexA Reporter 16. Bei diesem Verfahren Gensequenzen den Faktor LexA-VP16-Transkriptions Codierungs- und eine Calcium-empfindliche Protein NFAT miteinander verschmolzen. Calcium Aktivierung der Proteinphosphatase Calcineurin katalysiert die de-Phosphorylierung von NFAT und wiederum, facilitaTES seinen Import in den Zellkern. Im Kern bindet das LexA-Domäne in eine LexAop-DNA-Bindungsmotiv, das die Expression eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) reporter, wodurch nachhaltige Identifizierung von funktionell aktivierten Neuronen lenkt. Der Ansatz wurde erfolgreich zur Messung der Reaktion von spezifischen olfaktorischen Glomeruli im Antennallobus nach der Exposition von lebenden Fliegen Riechstoff 16 verwendet. Vor kurzem wurden die physiologischen Reaktionen von IR52c Geschmacks- Rezeptorneuronen von lebenden Fliegen gemessen mit CaLexA 7. Jedoch für diese Studie war es notwendig, zu altern Fliegen für bis zu 6 Wochen GFP Transkription zu erhöhen. Während Immunfärbung mit einem Anti-GFP-Antikörper verwendet werden kann, die CaLexA Signal zu verstärken, würde diese Methode Gewebefixierung erfordern, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird zum Abbilden lebenden Zellen.
Genetisch kodierte Calciumindikatorprotein GCaMP auch neuronale Reaktionen in einer Anzahl von zu studieren extensiv verwendet wurde,Spezies 17. Das Protein GCaMP fluoresziert mit geringer Intensität vor neuronale Stimulation. Anwendung eines Stimulus löst ein Aktionspotential in dem Neuron, wodurch der Einstrom von Ca 2+. GCaMP, gebunden an Ca 2+, erfährt eine Konformationsänderung, so dass es mit heller Intensität (Abbildung 1) zu fluoreszieren. Ein vor kurzem Single-Neuron – Kalzium – Imaging – Ansatz entwickelt wurde verwendet für die foreleg Neuronen spezifischen Gr61a Geschmacks- 18 Glukose als Ligand zu identifizieren. In dieser Studie wurden seziert Vorderbeine aus transgenen Drosophila exprimiert GCaMP in Gr61a gustatorischen Neuronen wurden mit einer Schicht aus Agarose vor der Bilderzeugung behandelt. Jedoch kann die Verwendung von sezierten Gewebe verursachen eventuelle Verminderung von GCaMP Expression, wodurch die Messzeit und die Erfassungsempfindlichkeit begrenzen. Zusätzlich kann Agarose begrenzen Empfindlichkeit aufgrund der hohen Hintergrundniveaus der Fluoreszenz und ihre Lichtstreuungseigenschaften.
To einige dieser Nachteile ansprechen, beschreiben wir die Verwendung von GCaMP-vermittelten Calcium Imaging physiologischen Reaktionen von foreleg und Rüssel Geschmacks- Neuronen intakter Tiere aufzunehmen. Wir zeigen die physiologischen Reaktionen von Gr68a und ppk23 Neuronen exprimieren genetisch kodierte GCaMP5G 19 einem Drosophila Lipid Pheromon, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronale Antworten werden durch Quantifizieren der Zunahme der Fluoreszenz des GCaMP5G Signals während Pheromon Stimulation gemessen. In diesem Protokoll Neuronen sind für eine Gesamtdauer von 120 sec abgebildet wird, wobei die Muster der neuronalen Aktivierung in einzelnen Zellen zu differenzieren ausreicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben hier eine Methode , um Live – Kalzium – Imaging von Drosophila peripheren Neuronen in 2 verschiedenen Sinnesorgane durchführen. Die Ca 2+ -evoked GCaMP fluoreszierende Reaktionen in Gr68a-Neuronen durch den Pheromon – Liganden induziert CH503 waren dosisabhängig und quantitativ. Es war auch möglich, verschiedene neuronale Antwortmuster wie phasic und Tonikum Antworten zu erkennen.
Neurons zeigt phasischen Reaktionen wird angenommen, dass eine schnelle A…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
Riferimenti
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