מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em> תסיסנית</em> עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
בניגוד ליונקים, חרקים כגון תסיסנית יש איברי טעם מרובים. הנוירונים chemosensory על הרגליים, חוטם, כנפיים צינור ההטלה של תסיסנית לבטא קולטנים gustatory 1,2, תעלות יונים 3-6, ו ionotropic קולטנים 7 כי מעורבים זיהוי של אותות חושיים תנודתי בלתי נדיף. נוירונים אלה קשר ישיר עם tastants כגון מזון, חומרים רעילים פרומונים ולכן להשפיע התנהגויות מורכבות רבות כגון האכלה, הטלה והזדווגות. קלטות אלקטרודה והדמית סידן כבר בשימוש נרחב חרקים לכמת את התגובות העצביות עוררו על ידי tastants אלה. עם זאת, אלקטרופיזיולוגיה דורש ציוד מיוחד ומדידות קבלה מתוך sensillum טעם יחיד יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית כתלות בתא-הסוג, הגודל, ואת המיקום. בנוסף, ברזולוציה נוירון בודד תסיסנית יכול להיות קשה להשיג מאז טעם sensilla house יותר מסוג אחד של נוירון chemosensory. שיטת הדמית סידן לחיות המתוארת כאן מאפשרת תגובות של נוירונים gustatory היחידים בזבובים חיים כדי להימדד. שיטה זו מתאימה במיוחד עבור הדמית תגובות עצביות פרומונים שומנים וסוגים ליגנד אחרים שיש להם מסיסות נמוכה ממס על בסיס מים.
Introduction
בעלי חיים להסתמך על מידע חוש הריח gustatory לתווך החלטות חיוניות להישרדות ולרבייה. הבנה כיצד רמזי chemosensory מזוהים ועובד על מערכת העצבים דורשת זיהוי של קולטן החישה (S) ואת הליגנדים הכימיים המתאימים. תסיסנית לזהות מגוון מדהים של תרכובות נדיפות ו בלתי נדיף מהווה מודל מצוין בו כדי ללמוד את פיזיולוגיים מנגנוני chemosensation. בעוד איברי ההרחה תופסים מולקולות נדיפות, איברי gustatory מתמחים לזהות תרכובות תנודתיות נמוכות. כאן, אנו מציגים שיטה למדוד תגובות עצביות ישירות מאיברי הטעם של תסיסנית אל תנודתיות נמוכה, הליגנדים lipophilic.
איברי Gustatory של הזבוב כוללים את הרגליים הקדמיות, חוטם, וכנפיים. מבוזרת על פני השטח של אברי טעם הם מבנים דמויי שיער המכונה sensilla המגיבים sugars, ביטר, מלחים, מים פרומונים 8. Sensilla סווג מורפולוגית לתוך זיפי טעם וטעם יתדות 9. ישנם כ 31 זיפי טעם על השפית כי המסווגים (L-type) הארוך, קצר (s-type) ביניים (i-סוג) מורפולוגיות. עצב סנסורי 'l' ו 's' sensilla בית 4 מגיבים פיסיולוגיים לסוכר (תא S), מלח נמוך (תא L1), מלח גבוה ותרכובות מרירות (תא L2) ומים (תא W) 10 , 11. ה'אני 'עצב סנסורי בית 2 sensilla, שאחד מהם מגיב הן מלח נמוך וסוכר, בעוד מגיב אחרת מלח גבוה 12. ישנם כ 41 טעם sensilla בזכרים ו -26 sensilla אצל נקבות מופצות על כל אחד הרגליים הקדמיות. עבור גברים ונשים כאחד, יש 21 sensilla על midleg, וכ -22 sensilla על hindleg 13. הנוירונים gustatory מוקפים הטעם sensilla על הרגליים גם גlassified לתוך L1, L2, W ו- S סוגים.
שיטה סטנדרטית אחת למדידת פעילות חשמלית מתא עצב יחיד בעזרת אלקטרודות תאיות או תאי להקליט זרימת יונים. מדידות אלקטרודה לאפשר תפקוד עצבי להיחקר באורגניזמים שאינם מודל כגון מינים תסיסנית, עש, ודבורים אשר חסרים כלים גנטיים נרחבים עבור תיוג עצבי. עם זאת, בעוד שיטות אלקטרו שימשו באופן שגרתי כדי למדוד את פעילות מן הטעם תסיסנית sensilla 4,13,14, החלת גישה זו מציגה מספר אתגרים טכניים. ראשית, לטעום זיפים צריכים להיות מזוהים המבוססים על מורפולוגיה ומיקום מרחבים. עם זיהוי, מדידות אלקטרו יכולות להתעכב על ידי גודלו הקטן של sensilla, מוגבל נגישות בשל מיקום, וקושי ביישום כרכים מבוקרים של גירוי כימי טעם זיפים. כמו כן, גירוי של sensilla עלול ליצור אותות יותר מאחדסוג עצבי 15. שנית, זיהוי של אותות חשמליים ניתן בתוהו בשל רעשי רקע נובעות תנודות מכאניות ורעש מציוד אלקטרוני. שלישית, השימוש של אלקטרודה חידד יכול לפגוע בהכנת לטוס, אם משתמשים בו בצורה לא נכונה 14. לבסוף, הרכבת אסדת אלקטרופיזיולוגיה דורשת רכיבים אלקטרוניים מיוחדים למסירת גירוי, אות הקלטה, וניתוח נתונים ויכול להיות יקר.
ב ד melanogaster, הזמינות של כלי הגנטי בקידוד יש להקל את הפיתוח של טכניקות הדמיה המאפשרות התגובות של אוכלוסיות קטנות של נוירונים להיחקר. גישה אחת כזו היא שימוש כתב CaLexA 16. בשיטה זו, רצפים הגן המקודד את גורם שעתוק LexA-VP16 לבין NFAT חלבון רגיש סידן הם התמזגו יחד. הפעלת סידן של calcineurin phosphatase חלבון מזרז את זרחון-דה של NFAT, בתורו, facilitaTES היבוא שלה לתוך הגרעין. בתוך הגרעין, תחום LexA נקשר מוטיב מחייב LexAop-DNA המכוון את הביטוי של החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כתב, ובכך מאפשר זיהוי מתמשך של נוירונים מופעלים מבחינה תפקודית. הגישה נוצלה בהצלחה כדי למדוד את התגובה של glomeruli חוש ריח הספציפי באונת המחושים בעקבות חשיפת זבובים לחיות עד odorant 16. לאחרונה, התגובות הפיזיולוגיות של נוירונים קולטן gustatory IR52c נמדדו מפני זבובים חיים באמצעות CaLexA 7. עם זאת, במחקר זה, היה צורך זבובי גיל עד 6 שבועות כדי לשפר שעתוק GFP. בעוד immunostaining עם נוגדן אנטי GFP ניתן להשתמש כדי להגביר את האות CaLexA, שיטה זו תחייב קיבעון רקמות, ובכך נמנעה האפשרות אפשרות דימות תאים חיים.
GCaMP חלבון מחוון סידן המקודד גנטי כמו כן נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד תגובות עצביות מספרמינים 17. החלבון GCaMP מאיר בעוצמה נמוכה לפני גירוי עצבי. יישום של גירוי מעורר פוטנציאל פעולה של נוירון, וכתוצאה מכך הזרם של Ca 2 +. GCaMP, חייב Ca 2 +, עובר שינוי קונפורמציה, גורם לו לזהור בעצמה בהירה (איור 1). גישת הדמיה שפותחה לאחרונה יחיד נוירון סידן שמשה לזיהוי גלוקוז ליגנד עבור נוירונים gustatory Gr61a הספציפיים הרגל הקדמי 18. במחקר זה, הרגליים הקדמיות גזור מן מהונדס תסיסנית להביע GCaMP בנוירונים gustatory Gr61a כוסו בשכבת agarose לפני הדמיה. עם זאת, השימוש ברקמה גזורה יכול לגרום מוזנח סופי ביטוי GCaMP, ובכך להגביל זמן מדידה רגיש זיהוי. בנוסף, agarose יכול להגביל רגישות בשל רמות רקע גבוהות של קרינה ומאפייני פיזור אור שלה.
To לטפל בכמה חסרונות אלה, אנו מתארים את השימוש של הדמיה סידן בתיווך GCaMP להקליט בתגובות הפיזיולוגיות רגל קדמית ו חוטם נוירונים gustatory של בבעלי חיים שלמים. אנו מציגים את התגובות הפיזיולוגיות של Gr68a ונוירונים ppk23 להביע מקודדים גנטית GCaMP5G 19 עד פרומון השומנים תסיסנית, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. תגובות עצביות נמדדות על ידי כימותי גידול הקרינה של אות GCaMP5G במהלך גירוי פרומון. בפרוטוקול זה, נוירונים הם צילמו למשך כולל של 120 שניות, וזה מספיק כדי להבחין בדפוסי ההפעלה העצבית תאים בודדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים כאן שיטה יש לבצע הדמית סידן חיה של נוירונים היקפיים לתסיסנית 2 אברי חישה שונים. Ca 2 + -evoked תגובות פלורסנט GCaMP ב Gr68a-נוירונים המושרים על ידי ליגנד פרומון CH503 היה תלוי מינון וכמותיים. זה היה גם ניתן להבחין דפוסי תגובה עצבית שונים כגון phasic ותגובות טוניק….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
Riferimenti
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
