मापने की शारीरिक प्रतिक्रियाओं<em> ड्रोसोफिला</em> लिपिड फेरोमोंस के लिए संवेदी न्यूरॉन्स लाइव कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
स्तनधारियों के विपरीत, इस तरह के ड्रोसोफिला के रूप में कीड़े कई स्वाद अंग होते हैं। पैर, सूंड, पंख और ड्रोसोफिला के अंडनिधानांग पर chemosensory न्यूरॉन्स स्वाद रिसेप्टर्स 1,2, आयन चैनल को 3-6, और ionotropic रिसेप्टर्स 7 कि अस्थिर और गैर वाष्पशील संवेदी संकेतों का पता लगाने में शामिल कर रहे हैं व्यक्त करते हैं। इन न्यूरॉन्स सीधे जैसे भोजन, हानिकारक पदार्थों और फेरोमोन के रूप में tastants संपर्क और इसलिए इस तरह खिला, अंडे बिछाने और संभोग के रूप में कई जटिल व्यवहार को प्रभावित करती है। इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग और कैल्शियम इमेजिंग व्यापक रूप से कीड़ों में इस्तेमाल किया गया है इन tastants द्वारा पैदा न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं यों की। हालांकि, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी विशेष उपकरणों और एक भी स्वाद sensillum से माप प्राप्त करने की आवश्यकता है सेल प्रकार, आकार और स्थिति के आधार पर तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, ड्रोसोफिला में एक न्यूरॉन संकल्प के बाद से स्वाद sensilla Hou प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता हैएसई chemosensory न्यूरॉन के एक से अधिक प्रकार। लाइव कैल्शियम इमेजिंग विधि यहाँ वर्णित लाइव मक्खियों में एकल स्वाद न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं को मापा जा सकता है। इस विधि लिपिड फेरोमोन और अन्य ligand प्रकार पानी आधारित सॉल्वैंट्स में कम घुलनशीलता है कि करने के लिए neuronal प्रतिक्रियाओं इमेजिंग के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।
Introduction
पशु घ्राण और स्वाद जानकारी पर भरोसा अस्तित्व और प्रजनन के लिए आवश्यक निर्णय मध्यस्थता करने के लिए। समझ कैसे chemosensory संकेतों का पता चला और तंत्रिका तंत्र द्वारा कार्रवाई की जाती है संवेदी रिसेप्टर (एस) और इसी रासायनिक ligands की पहचान की आवश्यकता है। ड्रोसोफिला अस्थिर और गैर अस्थिर यौगिकों का एक चौंका देने वाला किस्म का पता लगाने और जिसमें शारीरिक अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल हैं तंत्र chemosensation अंतर्निहित। घ्राण अंगों अस्थिर अणुओं में देखती है, वहीं स्वाद अंगों कम अस्थिरता यौगिकों का पता लगाने के लिए विशेष कर रहे हैं। यहाँ, हम एक विधि सीधे कम अस्थिरता, lipophilic ligands के लिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का स्वाद अंगों से न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए उपस्थित थे।
मक्खी के स्वाद अंगों forelegs, सूंड, और पंखों में शामिल हैं। स्वाद अंगों की सतह पर वितरित बाल की तरह sensilla रूप में जाना जाता संरचनाओं कि एस का जवाब हैंugars, कड़वाहट, लवण, पानी और फेरोमोन 8। Sensilla स्वाद जगमग में आकृति विज्ञान में वर्गीकृत किया गया है और स्वाद 9 खूंटे। वहाँ labellum है कि लंबे समय (एल प्रकार) के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं पर के बारे में 31 स्वाद जगमग, लघु (एस प्रकार) और मध्यवर्ती (i-प्रकार) morphologies हैं। 'एल' और 'एस' sensilla घर 4 संवेदी न्यूरॉन्स कि चीनी को physiologically प्रतिक्रिया (सेल), कम नमक (एल 1 सेल), उच्च नमक और कड़वा यौगिकों (एल 2 सेल) और पानी (डब्ल्यू सेल) 10 11। 'मैं' sensilla घर 2 संवेदी न्यूरॉन्स, कम नमक और चीनी के लिए दोनों का जवाब जिनमें से एक है, जबकि अन्य प्रतिक्रिया उच्च नमक से 12। पुरुषों में लगभग 41 स्वाद sensilla और forelegs में से प्रत्येक पर वितरित महिलाओं में 26 sensilla रहे हैं। पुरुषों और महिलाओं दोनों के लिए, वहाँ midleg पर 21 sensilla, और hindleg 13 पर के बारे में 22 sensilla हैं। स्वाद पैरों पर स्वाद sensilla से घिरा न्यूरॉन्स भी ग रहे हैंएल 1, एल 2, डब्ल्यू एस प्रकार में lassified।
एकल न्यूरॉन्स से बिजली की गतिविधि को मापने के लिए एक मानक विधि बाह्य या intracellular इलेक्ट्रोड का उपयोग करता आयन प्रवाह रिकॉर्ड करने के लिए। इलेक्ट्रोड माप न्यूरोनल समारोह में इस तरह ड्रोसोफिला प्रजातियों, पतिंगे, और मधुमक्खियों जो तंत्रिका लेबलिंग के लिए व्यापक आनुवंशिक उपकरणों की कमी के रूप में गैर-मॉडल जीवों में अध्ययन किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, जबकि electrophysiological तरीकों को नियमित 4,13,14 sensilla ड्रोसोफिला स्वाद से गतिविधि को मापने के लिए, इस दृष्टिकोण को लागू करने में इस्तेमाल किया गया है कई तकनीकी चुनौतियों प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, जगमग आकृति विज्ञान और स्थानिक स्थान के आधार पर पहचान किए जाने की जरूरत स्वाद। पहचान पर, electrophysiological माप, sensilla के छोटे आकार के द्वारा बाधा जा सकता है स्थिति के कारण सीमित पहुंच, और एक स्वाद के लिए एक रासायनिक प्रोत्साहन की नियंत्रित मात्रा में लागू करने में कठिनाई बाल खड़े। इसके अलावा, sensilla की उत्तेजना से अधिक से संकेत उत्पन्न हो सकता हैन्यूरोनल प्रकार 15। दूसरा, विद्युत संकेतों का पता लगाने पृष्ठभूमि इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों से यांत्रिक कंपन और शोर से उत्पन्न शोर से चकित किया जा सकता है। तीसरा, एक तेज इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हैं, मक्खी तैयारी नुकसान पहुंचा सकता है अगर गलत तरीके से 14 का इस्तेमाल किया। अंत में, एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग कोडांतरण प्रोत्साहन वितरण, संकेत रिकॉर्डिंग, और डेटा विश्लेषण के लिए विशेष इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों की आवश्यकता है और महंगा हो सकता है।
डी में मेलानोगास्टर, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों की उपलब्धता इमेजिंग तकनीक है कि न्यूरॉन्स की छोटी आबादी की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन किया जा करने की अनुमति के विकास में मदद की है। ऐसा ही एक दृष्टिकोण CaLexA रिपोर्टर 16 का इस्तेमाल होता है। इस विधि में, LexA-VP16 प्रतिलेखन कारक है और एक कैल्शियम संवेदनशील प्रोटीन NFAT एन्कोडिंग जीन दृश्यों को एक साथ जुड़े हुए हैं। प्रोटीन फॉस्फेट calcineurin की कैल्शियम सक्रियण NFAT के डी-फोस्फोराइलेशन उत्प्रेरित और बदले, facilita में,नाभिक में इसके आयात टीईएस। नाभिक के अंदर, LexA डोमेन एक LexAop डीएनए बाध्यकारी मूल भाव है जो एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) रिपोर्टर की अभिव्यक्ति का निर्देशन, इस प्रकार कार्यात्मक सक्रिय न्यूरॉन्स की निरंतर पहचान की अनुमति को बांधता है। दृष्टिकोण सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है एक odorant 16 को लाइव मक्खियों के प्रदर्शन के बाद antennal पालि में विशिष्ट घ्राण केशिकागुच्छ की प्रतिक्रिया को मापने के लिए। हाल ही में, IR52c स्वाद रिसेप्टर न्यूरॉन्स की शारीरिक प्रतिक्रियाओं CaLexA 7 का उपयोग कर लाइव मक्खियों से मापा गया। हालांकि, इस अध्ययन के लिए, यह उम्र मक्खियों के लिए आवश्यक ऊपर से 6 सप्ताह GFP प्रतिलेखन बढ़ाने के लिए किया गया था। एक विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ immunostaining CaLexA सिग्नल को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस विधि ऊतक निर्धारण की आवश्यकता होगी, इस प्रकार रहते सेल इमेजिंग के लिए संभावना precluding।
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सूचक प्रोटीन GCaMP भी बड़े पैमाने पर की एक संख्या में neuronal प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैप्रजातियों 17। प्रोटीन GCaMP न्यूरोनल उत्तेजना से पहले कम तीव्रता के साथ fluoresces। एक प्रोत्साहन के अनुप्रयोग, न्यूरॉन में एक संभावित कार्रवाई हो सके सीए 2 की आमद हो जाती है। GCaMP, सीए 2 के लिए बाध्य है, एक गठनात्मक बदलाव आए, यह चमक तीव्रता (चित्रा 1) के साथ प्रतिदीप्ति के कारण। हाल ही में विकसित एकल न्यूरॉन कैल्शियम इमेजिंग दृष्टिकोण अगली टांग विशिष्ट स्वाद Gr61a न्यूरॉन्स 18 के लिए ligand के रूप में ग्लूकोज की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस अध्ययन में, Gr61a स्वाद न्यूरॉन्स में GCaMP व्यक्त ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला से विच्छेदित forelegs agarose इमेजिंग के लिए पहले की एक परत के साथ कवर किया गया। हालांकि, विच्छेदित ऊतक का उपयोग GCaMP अभिव्यक्ति की अंतिम ठहरनेवाला पैदा कर सकता है, इस प्रकार माप समय और संवेदनशीलता का पता लगाने सीमित। इसके अलावा, agarose प्रतिदीप्ति के उच्च स्तर पृष्ठभूमि और इसकी रोशनी बिखरने गुणों के कारण संवेदनशीलता सीमित कर सकते हैं।
टीओ इन कमियों के कुछ पता है, हम GCaMP की मध्यस्थता कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग अगली टांग और सूंड बरकरार जानवरों का स्वाद न्यूरॉन्स से शारीरिक प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने का वर्णन है। हम शारीरिक एक ड्रोसोफिला लिपिड फेरोमोन के लिए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग GCaMP5G 19 व्यक्त (3 आर, 11 जेड, 19 जेड) Gr68a की प्रतिक्रियाओं और ppk23 न्यूरॉन्स, -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-राजभाषा (CH503) 20 दिखाने के लिए, 21। Neuronal प्रतिक्रियाओं फेरोमोन उत्तेजना के दौरान GCaMP5G संकेत के प्रतिदीप्ति में वृद्धि बढ़ाता द्वारा मापा जाता है। इस प्रोटोकॉल में, न्यूरॉन्स 120 सेकंड है, जो व्यक्ति की कोशिकाओं में neuronal सक्रियण के पैटर्न को अलग करने के लिए पर्याप्त है की कुल अवधि के लिए imaged हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ 2 अलग संवेदी अंगों में ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स की कैल्शियम इमेजिंग लाइव प्रदर्शन करने के लिए एक विधि का वर्णन। सीए 2 Gr68a-न्यूरॉन्स फेरोमोन ligand CH503 खुराक पर निर्भर है और मात्रात्मक थे द्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
Riferimenti
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