Måling fysiologiske responser av<em> Drosophila</em> Sensoriske nevroner til Lipid Pheromones Bruke levende Kalsium Imaging
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
I motsetning til pattedyr, insekter slik som Drosophila har flere smaksorganer. De chemosensory nevroner på beina, snabel, vinger og ovipositor av Drosophila uttrykke smaksreseptorer 1,2, ionekanaler 3-6, og ionotrope reseptorer 7 som er involvert i deteksjon av flyktige og ikke-flyktige sanse signaler. Disse nervecellene direkte kontakt tastants som mat, skadelige stoffer og feromoner og derfor påvirke mange komplekse atferd som fôring, egg-legging og mating. Elektrode opptak og kalsium bildebehandling har vært mye brukt i insekter å kvantifisere nevrale responser fremkalt av disse tastants. Imidlertid krever elektro spesialisert utstyr og å innhente målinger fra en enkelt smak sensillum kan være teknisk utfordrende avhengig av celletype, størrelse og posisjon. I tillegg kan enkelt Nevron oppløsningen i Drosophila være vanskelig å oppnå siden smak sensilla house mer enn én type chemosensory nervecellen. Det levende kalsium avbildningsmetode som er beskrevet her kan reaksjoner fra enkeltsmaks nevroner i levende fluer som skal måles. Denne fremgangsmåte er særlig egnet for avbilding av neuronal respons på lipid feromoner og andre ligand-typer som har lav løselighet i vannbaserte løsningsmidler.
Introduction
Dyr er avhengige av olfactory og gustatory informasjon å formidle avgjørelser avgjørende for overlevelse og reproduksjon. Å forstå hvordan chemosensory signaler blir detektert og behandlet av nervesystemet krever identifikasjon av den sensoriske reseptor (er) og de tilsvarende kjemiske ligander. Drosophila detektere en forbløffende rekke av flyktige og ikke-flyktige forbindelser og er en utmerket modell for å studere de fysiologiske mekanismer underliggende chemosensation. Mens luktorganer oppfatter flyktige molekyler, blir smaksorganene spesialisert til å detektere lave volatilitet forbindelser. Her presenterer vi en metode for å direkte måle nerve svar fra smaksorganene Drosophila melanogaster til lav volatilitet lipofile ligander.
Gustatory organer i fly inkluderer forbena, snabel og vinger. Fordelt på overflaten av smaksorganene er hår-lignende strukturer kjent som sensilla som reagerer på sugars, bitter, salt, vann og feromoner 8. Den sensilla er klassifisert morfologisk inn smaks bust og smak plugger 9. Det er ca 31 smaks bustene på labellum som er klassifisert i den lange (l-type), kort (s-type) og middels (i-type) morfologi. "L" og "s" sensilla hus 4 sensoriske nevroner som reagerer fysiologisk til sukker (S celle), lav salt (L1 celle), høy salt og bitre forbindelser (L2 celle) og vann (W celle) 10 , 11. 'I' sensilla huset 2 sensoriske nevroner, hvorav den ene reagerer både lite salt og sukker, mens andre reagerer på høy salt 12. Det er ca 41 smak sensilla hos menn og 26 sensilla hos kvinner fordelt på hver av forbena. For både menn og kvinner, er det 21 sensilla på midleg, og ca 22 sensilla på bakben 13. De smaks nevroner omsluttet av smaken sensilla på beina er også classified inn L1, L2, W og S-typer.
En standard metode for måling av elektrisk aktivitet fra enkelt nevroner bruker ekstracellulære eller intracellulære elektroder til posten ion flyt. Elektrodemålinger tillate neuronal funksjon å bli studert i ikke-modellorganismer som Drosophila arter, møll, og bier som mangler omfattende genetiske verktøy for nevrale merking. Men mens elektrofysiologiske metoder har blitt rutinemessig brukt for å måle aktivitet fra Drosophila smak sensilla 4,13,14, bruke denne tilnærmingen presenterer flere tekniske utfordringer. Først smake bust må identifiseres basert på morfologi og romlig plassering. Ved identifikasjon, kan elektrofysiologiske målinger bli hindret av den lille størrelsen på sensilla, begrenset tilgjengelighet på grunn av stilling, og vanskeligheter med å anvende kontrollerte volumer av en kjemisk stimulans til en smak bust. Dessuten kan stimulering av sensilla generere signaler fra mer enn ettnevronale type 15. For det andre kan påvisning av elektriske signaler forvirres av bakgrunnsstøy som følge av mekaniske vibrasjoner og støy fra elektronisk utstyr. For det tredje, kan bruk av en skjerpet elektrode skade flue preparat, hvis det brukes feil 14. Til slutt, montering en elektrofysiologi rigg krever spesialiserte elektroniske komponenter for stimulans levering, signal opptak, og dataanalyse, og kan være kostbart.
I D. melanogaster, har tilgjengeligheten av genetisk kodede verktøy muliggjort utvikling av avbildningsteknikker som tillater responsene til små populasjoner av neuroner som skal studeres. En slik metode er bruken av rapportør CaLexA 16. I denne metoden, blir gensekvenser som koder for lexa-VP16 transkripsjonsfaktor og en kalsiumfølsom protein NFAT smeltet sammen. Kalsium aktivering av proteinfosfatasen kalsineurin katalyserer de-fosforylering av NFAT og, i sin tur, facilitaTES sin import til kjernen. Inne i kjernen, den lexa domene bindes til en LexAop-DNA-bindende motiv som dirigerer ekspresjonen av et grønt fluorescerende protein (GFP) reporter, og dermed gir vedvarende identifikasjon av funksjonelt aktiverte neuroner. Tilnærmingen har vært brukt med hell til å måle responsen til spesifikke olfactory glomeruli i antennal lapp etter eksponering av levende fluer til en odorant 16. Nylig ble det fysiologiske responser av IR52c smaks reseptor nerveceller målt fra levende fluer ved hjelp CaLexA 7. Men for denne studien, var det nødvendig å alder fluer i opptil 6 uker, for å forbedre GFP transkripsjon. Mens immunofarging med et anti-GFP-antistoff kan anvendes for å øke CaLexA signal, vil denne fremgangsmåte kreve vev fiksering, og dermed utelukker muligheten for levende celle avbildning.
Den genetisk kodede kalsium indikatorprotein GCaMP har også blitt mye brukt til å studere neuronal respons på en rekkearter 17. Proteinet GCaMP fluoresces med lav intensitet før nervestimulering. Bruk av en stimulus utløser et aksjonspotensial i nervecellen, noe som resulterer i tilstrømningen av Ca 2+. GCaMP, bundet til Ca 2+, gjennomgår en konformasjonsendring, forårsaker den til å fluorescere med lysere intensitet (figur 1). En nylig utviklet single-nevron kalsium bildebehandling tilnærming ble brukt til å identifisere glukose som ligand for forben spesifikke Gr61a smaks nevroner 18. I denne studien ble dissekert forben fra transgene Drosophila uttrykker GCaMP i Gr61a smaks nevroner dekket med et lag av agarose før bildebehandling. Imidlertid kan bruken av dissekerte vev forårsake eventuelt trekk av GCaMP ekspresjon, noe som begrenser måletiden og deteksjonsfølsomheten. I tillegg agarose kan begrense følsomhet på grunn av høye bakgrunnsnivåer av fluorescens og dens lysspredningsegenskaper.
To ta opp noen av disse ulempene, beskriver vi bruk av GCaMP-mediert kalsium bildebehandling for å registrere fysiologiske responser fra forben og snabel smaks nevroner av intakte dyr. Vi viser de fysiologiske responsene til Gr68a og ppk23 neuroner som uttrykker genetisk kodet GCaMP5G 19 til en Drosophila lipid feromon, (3-R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoksy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronal responser måles ved å kvantifisere økningen i fluorescens over den GCaMP5G signal i løpet av feromon stimulering. I denne protokollen blir neuroner avbildes for en total varighet på 120 sekunder, som er tilstrekkelig til å skille mønstre av neuronal aktivering i individuelle celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her en metode for å opptre live kalsium avbildning av Drosophila perifere nerveceller i 2 forskjellige sanseorganer. Ca 2+ -evoked GCaMP fluorescerende responser i Gr68a-nerveceller indusert ved hjelp av feromonet liganden CH503 var doseavhengig og kvantitative. Det var også mulig å skjelne ulike nevrale reaksjonsmønstrene som phasic og tonic svar.
Nerveceller viser phasic svar antas å tillate rask tilpasning til kontinuerlig stimuli. Denne type reaksjon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
Riferimenti
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
