Medindo respostas fisiológicas de<em> Drosophila</em> Neurônios sensoriais para Lipid feromonas Usando Imagem de cálcio ao vivo
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
Ao contrário dos mamíferos, insetos, como Drosophila têm múltiplos órgãos gustativas. Os neurônios quimio nas pernas, tromba, asas e ovipositor de Drosophila expressam receptores gustativos 1,2, canais iônicos 3-6 e receptores ionotrópicos 7 que estão envolvidos na detecção de sinais sensoriais voláteis e não-voláteis. Esses neurônios contactar directamente tastants, como alimentos, substâncias nocivas e feromonas e, portanto, influenciar muitos comportamentos complexos, tais como alimentação, postura de ovos e acasalamento. gravações dos eléctrodos e imagem de cálcio têm sido largamente utilizados em insectos para quantificar as respostas neuronais evocados por estes saborizantes. No entanto, eletrofisiologia exige equipamento especializado e medições obtenção de um único sensillum gosto pode ser tecnicamente desafiador, dependendo do tipo de célula, tamanho e posição. Além disso, a única resolução neurônio em Drosophila pode ser difícil de alcançar, uma vez hou gosto sensillase mais de um tipo de neurônio quimio. O método de imagem de cálcio ao vivo descrito aqui permite respostas dos neurônios gustativas de solteiro em moscas ao vivo a ser medido. Este método é especialmente adequado para imagiologia de respostas neuronais a feromonas de lípidos e outros tipos de ligandos que têm baixa solubilidade em solventes à base de água.
Introduction
Animais confiar na informação olfativa e gustativa para mediar decisões essenciais para a sobrevivência e reprodução. Entender como pistas quimio são detectados e processados pelo sistema nervoso exige a identificação do receptor sensorial (s) e os ligandos químicos correspondentes. Drosophila detectar uma variedade impressionante de compostos voláteis e não-voláteis e são um excelente modelo para estudar o fisiológica mecanismos subjacentes chemosensation. Enquanto os órgãos olfactivos perceber moléculas voláteis, os órgãos gustativas são especializados para detectar compostos de baixa volatilidade. Aqui, apresentamos um método para medir diretamente as respostas neuronais dos órgãos gosto de Drosophila melanogaster a baixa volatilidade, ligantes lipofílicos.
órgãos gustativos da mosca incluem os anteriores, tromba, e asas. Distribuído sobre a superfície dos órgãos gustativas são estruturas semelhantes a cabelos conhecidos como sensilas que respondem a sugars, bitters, sais, água e feromônios 8. O sensilla foram classificados morfologicamente em cerdas de gosto e sabor pinos 9. Há cerca de 31 cerdas gosto no labelo que são classificados em A longo (tipo L), curto (s-tipo) e morfologias intermediários (-tipo I). Sensilla casa 4 neurônios sensoriais Os 'L' e 'S' que respondem fisiologicamente ao açúcar (a célula S), baixo teor de sal (a célula L1), alta sal e compostos amargos (a célula L2) e água (a célula W) 10 , 11. O "eu" casa 2 neurônios sensilla sensoriais, uma das quais responde tanto à baixa sal e açúcar, enquanto que outro que responde à elevada de sal 12. Há aproximadamente 41 sensilas sabor em machos e fêmeas em 26 sensilas distribuídos em cada uma das pernas dianteiras. Para ambos os sexos masculino e feminino, há 21 sensilas na midleg, e cerca de 22 sensilas na hindleg 13. Os neurônios gustativos fechados pela sensilla gosto nas pernas também são classified em tipos de L1, L2, W e S.
Um método padrão para medir a atividade elétrica dos neurônios individuais utiliza eletrodos extracelulares ou intracelulares para gravar o fluxo de íons. Medições dos eléctrodos permitem função neuronal a ser estudado em organismos não-modelo como as espécies Drosophila, mariposas, abelhas e que não possuem extensas ferramentas genéticas para a rotulagem neural. No entanto, enquanto os métodos eletrofisiológicos têm sido rotineiramente usado para medir a atividade de Drosophila gosto sensilla 4,13,14, aplicando esta abordagem apresenta vários desafios técnicos. Primeiro, gosto cerdas precisam ser identificados com base na morfologia e localização espacial. Após a identificação, medidas eletrofisiológicas pode ser prejudicado pela pequena dimensão do sensilla, limitando a acessibilidade devido à posição e dificuldade em aplicar volumes controladas de um estímulo químico a um gosto de cerdas. Além disso, a estimulação de sensilas podem gerar sinais a partir de mais do que umneuronal tipo 15. Em segundo lugar, a detecção de sinais elétricos podem ser confundidos com o ruído de fundo resultantes das vibrações mecânicas e ruído de equipamentos eletrônicos. Em terceiro lugar, a utilização de um eléctrodo afiado pode danificar a preparação mosca, se utilizado incorrectamente 14. Finalmente, a montagem de uma plataforma de eletrofisiologia requer componentes eletrônicos especializados para a entrega de estímulo, gravação de sinal e análise de dados e pode ser caro.
Em D. melanogaster, a disponibilidade de ferramentas geneticamente codificados tem facilitado o desenvolvimento de técnicas de imagiologia que permitem que as respostas de pequenas populações de neurónios a ser estudado. Uma tal abordagem é a utilização do repórter CaLexA 16. Neste método, as sequências de gene que codifica o factor de transcrição VP16-LexA e uma proteína NFAT sensível ao cálcio são fundidos em conjunto. activação de cálcio da calcineurina fosfatase proteína catalisa a fosforilação de de-NFAT e, por sua vez, a FacilitaTES sua importação para o núcleo. No interior do núcleo, o domínio de LexA se liga a um motivo de ligação a DNA-LexAop que dirige a expressão de uma proteína fluorescente verde repórter (GFP), permitindo assim a identificação de neurónios sustentada funcionalmente activado. A abordagem tem sido utilizada com sucesso para medir a resposta de glomérulos olfactiva específica no lobo antenal após a exposição das moscas ao vivo a um odorante 16. Recentemente, as respostas fisiológicas de neurônios receptores gustativos IR52c foram medidos a partir moscas ao vivo usando CaLexA 7. No entanto, para este estudo, foi necessário moscas de idade para até 6 semanas para aumentar a transcrição GFP. Enquanto a imunocoloração com um anticorpo anti-GFP podem ser usadas para aumentar o sinal CaLexA, este método exige a fixação do tecido, evitando, assim, possibilidade de processamento de imagem de células vivas.
O cálcio GCaMP proteína indicadora geneticamente codificado também tem sido amplamente utilizado para estudar as respostas neuronais em váriosespécies 17. O GCaMP proteína fluorescente com baixa intensidade antes da estimulação neuronal. Aplicação de um estímulo desencadeia um potencial de acção no neurónio, resultando no influxo de Ca 2+. GCaMP, ligado ao Ca2 +, sofre uma alteração conformacional, fazendo com que a fluorescência com intensidade mais brilhante (Figura 1). Uma abordagem de imagem de cálcio para neurónios único recentemente desenvolvido foi utilizado para identificar a glicose como o ligando para os neurónios pata dianteira gustativos Gr61a específicos 18. Neste estudo, pernas dianteiras dissecados de Drosophila transgênicos expressando GCaMP em neurônios gustativos Gr61a foram cobertos com uma camada de agarose antes da imagem. No entanto, a utilização de tecido dissecado pode causar eventual degradação de expressão GCaMP, limitando, assim, o tempo de medição e detecção de sensibilidade. Além disso, agarose pode limitar a sensibilidade devido aos altos níveis de fundo de fluorescência e suas propriedades de dispersão de luz.
To abordar alguns destes inconvenientes, descrevemos o uso de imagem de cálcio GCaMP mediada para gravar as respostas fisiológicas de pata dianteira e tromba neurônios gustativas de animais intactos. Mostramos as respostas fisiológicas de Gr68a e neurónios que expressam ppk23 geneticamente codificado GCaMP5G 19 a uma feromona de lípidos de Drosophila, (3R, 11 Z, 19, Z) -3-acetoxi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. respostas neuronais são medidos por quantificação do aumento na fluorescência do sinal GCaMP5G durante a estimulação de feromonas. Neste protocolo, os neurônios são gravadas para uma duração total de 120 segundos, o que é suficiente para diferenciar padrões de ativação neuronal em células individuais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos aqui um método para realizar imagem de cálcio ao vivo de neurônios periféricos Drosophila em 2 órgãos sensoriais diferentes. O Ca 2+ -evoked respostas fluorescentes GCaMP em Gr68a-neurônios induzida pelo ligando feromônio CH503 foram dose-dependentes e quantitativa. Também foi possível discernir diferentes padrões de resposta neural, tais como fásicas e tônicas respostas.
Neurônios que mostram respostas fásicas são acreditados para permitir uma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
Riferimenti
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