Att mäta fysiologiska reaktioner av<em> Drosophila</em> Sensoriska neuroner till Lipid Feromoner Använda Live Kalcium Imaging
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
Till skillnad från däggdjur, insekter såsom Drosophila har flera smak organ. De chemosensory neuroner på benen, snabel, vingar och gadd Drosophila uttrycka smakreceptorer 1,2, jonkanaler 3-6, och jonotropa receptorer 7 som är inblandade i upptäckten av flyktiga och icke-flyktiga sensoriska signaler. Dessa nervceller kontakta tastants såsom mat, skadliga ämnen och feromoner och därför påverka många komplexa beteenden såsom utfodring, äggläggning och parning. Elektrod inspelningar och kalcium avbildning har använts i stor utsträckning i insekter att kvantifiera de neuronala svaren framkallade av dessa tastants. Kräver emellertid elektrospecialutrustning och att utföra mätningar från en enda smak sensillum kan vara tekniskt utmanande beroende på celltyp, storlek och position. Dessutom kan enstaka neuron upplösning i Drosophila vara svårt att uppnå eftersom smak sensilla house mer än en typ av Chemosensory neuron. Den levande kalciumavbildningsmetod som beskrivs här tillåter svar enskilda smak nervceller i levande flugor som skall mätas. Denna metod är särskilt lämplig för avbildning av neuronala svar på lipid feromoner och andra ligand typer som har låg löslighet i vattenbaserade lösningsmedel.
Introduction
Djur är beroende av lukt och luktintrycket uppgifter att förmedla beslut som är nödvändiga för överlevnad och fortplantning. Att förstå hur Chemosensory signaler upptäcks och behandlas av nervsystemet kräver identifiering av sensorisk receptor (er) och motsvarande kemiska ligander. Drosophila upptäcka en häpnadsväckande mängd flyktiga och icke-flyktiga föreningar och är en utmärkt modell för att studera fysiologiska mekanismer som ligger till grund chemosensation. Medan luktorganen uppfattar flyktiga molekyler, de smak organ specialiserade för att detektera låga volatilitet föreningar. Här presenterar vi en metod för att direkt mäta neuronala svar från smak organ Drosophila melanogaster till låg volatilitet, lipofila ligander.
Smak organ flugan inkluderar frambenen, snabel, och vingar. Fördelad på ytan av smak organ är hårliknande strukturer kända som sensilla som svarar på sugars, bitter, salter, vatten och feromoner 8. Den sensilla har klassificerats morfologiskt i smak borst och smak pinnar 9. Det finns ungefär 31 smak borst på labellum som klassificeras i den långa (L-typ), kort (S-typ) och mellanliggande (I-typ) morfologier. "L" och "S" sensilla hus 4 sensoriska neuroner som svarar fysiologiskt socker (S cell), låg salt (L1 cell), hög salt och bittra föreningar (L2 cell) och vatten (W cell) 10 , 11. 'I' sensilla hus 2 sensoriska neuroner, av vilka den ena svarar både låg salt och socker, medan den andra svarar på hög salt 12. Det finns cirka 41 smak sensilla hos män och 26 sensilla hos kvinnor fördelat på vart och ett av frambenen. För både män och kvinnor, det finns 21 sensilla på midleg, och cirka 22 sensilla på bakben 13. De smak nervceller omges av smaken sensilla på benen är också classified i L1, L2, W och S typer.
En standardmetod för mätning av elektrisk aktivitet från enstaka nervceller använder extracellulära eller intracellulära elektroder för att spela jonflöde. Elektrod mätningar tillåter neuronal funktion som skall studeras i icke-modellorganismer såsom Drosophila arter, nattfjärilar och bin som saknar omfattande genetiska verktyg för neurala märkning. Men medan elektrofysiologiska metoder har rutinmässigt används för att mäta aktiviteten från Drosophila smak sensilla 4,13,14, tillämpa denna metod uppvisar flera tekniska utmaningar. Först smak borst måste identifieras baserat på morfologi och rumslig plats. Vid identifiering, kan elektrofysiologiska mätningar hindras av den lilla storleken på sensilla, begränsad tillgänglighet på grund av läget och svårigheter att tillämpa kontrollerade volymer av en kemisk stimulans till en smak borst. Dessutom kan stimulering av sensilla generera signaler från fler än enneuronal typ 15. För det andra, kan detektering av elektriska signaler förväxlas med bakgrundsbrus till följd av mekaniska vibrationer och buller från elektronisk utrustning. För det tredje, kan användningen av en vass elektrod skada flugan preparatet, om de används på fel sätt 14. Slutligen, montering en elektro riggen kräver specialiserade elektroniska komponenter för stimulans leverans, signal inspelning, och dataanalys och kan bli kostsamt.
I D. melanogaster, har tillgången på genetiskt kodade verktyg underlättat utvecklingen av avbildningstekniker som gör att svaren från små populationer av nervceller som ska studeras. Ett sådant tillvägagångssätt är användningen av den CaLexA reporter 16. I denna metod, är gensekvenser som kodar för LexA-VP16-transkriptionsfaktorn och ett kalciumkänsligt protein NFAT sammansvetsade. Kalcium aktivering av protein fosfatas kalcineurin katalyserar de-fosforylering av NFAT och, i sin tur, facilitates sin import till kärnan. Inuti kärnan, binder LexA-domänen till en LexAOp-DNA-bindande motivet som styr uttrycket av ett grönt fluorescerande protein (GFP) reporter, vilket möjliggör fördröjd identifiering av funktionellt aktiverade neuroner. Tillvägagångssättet har använts framgångsrikt för att mäta hur specifika lukt glomeruli i antenn loben efter exponering av levande flugor till ett luktämne 16. Nyligen har fysiologiska reaktioner av IR52c smakreceptor nervceller mätt från levande flugor använder CaLexA 7. Men för denna studie, var det nödvändigt att ålders flugor i upp till sex veckor för att förbättra GFP transkription. Medan immunfärgning med en anti-GFP-antikropp kan användas för att öka CaLexA signalen skulle denna metod kräver vävnadsfixering, vilket således innebär att möjligheten för levande cell imaging.
Den genetiskt kodade kalciumindikatorprotein GCaMP har också i stor utsträckning använts för att studera neuronala responser i ett antalarter 17. Proteinet GCaMP fluorescerar med låg intensitet före neuronal stimulering. Tillämpning av en stimulans utlöser en aktionspotential i neuron, vilket resulterar i tillströmningen av Ca2 +. GCaMP skyldig att Ca2 +, genomgår en strukturförändring, vilket gör att fluorescera med ljusare intensitet (Figur 1). Ett nyligen utvecklat enkel neuron kalciumavbildningsteknik användes för att identifiera glukos som ligand för frambenet specifika Gr61a smak neuroner 18. I denna studie, dissekerades framben från transgena Drosophila som uttrycker GCaMP i Gr61a smak nervceller täckt med ett lager av agaros före avbildning. Emellertid kan användningen av dissekerade vävnaden orsaka eventuell genomgång av GCaMP uttryck, vilket begränsar mättid och detektionskänslighet. Dessutom, agaros kan begränsa känsligheten på grund av höga bakgrundsnivåer av fluorescens och dess ljusspridande egenskaper.
To ta itu med några av dessa nackdelar beskriver vi användningen av GCaMP-medierad kalcium avbildning för att spela in fysiologiska reaktioner från framben och snabel smak neuroner i intakta djur. Vi visar de fysiologiska svaren från Gr68a och ppk23 neuroner som uttrycker genetiskt kodad GCaMP5G 19 till en Drosophila lipid feromon, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronala responser mäts genom att kvantifiera ökningen i fluorescens av GCaMP5G signalen under feromon stimulering. I detta protokoll, är nervceller avbildas för sammanlagt minst 120 sek, vilket är tillräckligt för att särskilja mönster av neuronal aktivering i enskilda celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver här en metod för att spela live kalcium avbildning av Drosophila perifera neuroner i 2 olika sinnesorgan. Ca2 + -evoked GCaMP fluorescerande svar i Gr68a-neuroner inducerade av feromonet liganden CH503 var dosberoende och kvantitativ. Det var också möjligt att urskilja olika neurala svarsmönster som phasic och tonic svar.
Neuroner visar phasic svar tros möjliggöra en snabb anpassning till kontinuerliga stimuli. Denna typ av svar har satts i samband med…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
Riferimenti
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
