Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Paula Nunes; Daniele Guido; Nicolas Demaurex

doi:10.3791/53402

Articolo metodologico

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

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DOI:

10.3791/53402

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7 dicembre 2015

Paula Nunes¹ , Daniele Guido¹ , Nicolas Demaurex¹

¹Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

In questo articolo

Sommario

Il pH fagosomico influenza la maturazione dei fagosomi, la produzione di ossidanti, l'uccisione fagosomiale e la presentazione dell'antigene. Qui descriviamo un metodo raziometrico per misurare le variazioni di pH nel corso temporale e nel punto finale nei singoli fagosomi nei fagociti viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Abstract

Fagocitosi è un processo fondamentale attraverso il quale le cellule immunitarie innate fagocitare batteri, cellule apoptotiche o altre particelle estranee al fine di uccidere o neutralizzare il materiale ingerito, o di presentarlo come antigeni e di avviare le risposte immunitarie adattive. Il pH di fagosomi è un parametro critico regolazione fissione o fusione con endomembrane e l'attivazione degli enzimi proteolitici, eventi che permettono al vacuolo fagocitosi di maturare in un organello degradativa. Inoltre, è richiesto di traslocazione H ⁺ per la produzione di elevati livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che sono essenziali per l'uccisione efficiente e segnalazione ad altri tessuti dell'ospite. Molti patogeni intracellulari sovvertono uccisione fagocitico limitando phagosomal acidificazione, sottolineando l'importanza del pH in phagosome biologia. Qui si descrive un metodo per misurare raziometrica phagosomal pH nei neutrofili con fluoresceina isotiocianato (FITC) -labeled zymosan come phagocytic targETS e live-cell imaging. Il saggio si basa sulle proprietà di fluorescenza di FITC, che si spegne da pH acido quando eccitato a 490 nm ma non quando eccitato a 440 nm, permettendo la quantificazione di un rapporto pH-dipendente, piuttosto che di fluorescenza assoluta, di un singolo colorante. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l'esecuzione in loco di calibrazione tintura e la conversione del rapporto di valori reali di pH. Single-dye metodi raziometriche sono generalmente considerati superiori a singola lunghezza d'onda o protocolli pseudo-raziometrico dual-dye, in quanto sono meno sensibili alle perturbazioni, come lo sbiancamento, concentrarsi modifiche, variazioni laser, e l'etichettatura irregolare, che distorcono il segnale misurato. Questo metodo può essere facilmente modificato per misurare il pH in altri tipi di cellule fagocitiche e zymosan può essere sostituita da qualsiasi altra particella contenente ammina, da perline inerti ai microrganismi viventi. Infine, questo metodo può essere adattato a fare uso di altre sonde fluorescenti sensibili a diversi intervalli di pH o altri phagosomattività al, rendendolo un protocollo generale per l'imaging funzionale di fagosomi.

Introduzione

La fagocitosi, il processo attraverso il quale le cellule immunitarie innate inghiottono particelle di grandi dimensioni, si è evoluta dal meccanismo alimentare degli organismi unicellulari, e comporta il legame con un bersaglio, avvolgendolo con una membrana e pizzicando la membrana per formare un vacuolo all'interno del citosol chiamato fagosoma. Mentre la membrana fagosomiale è derivata dalla membrana plasmatica, lo smistamento attivo delle proteine e dei lipidi, così come la fusione con le endomembrane durante la formazione dei fagosomi, trasformano il fagosoma in un organello distinto all'interno della cellula con proprietà degradative che consentono l'uccisione,....