एक सेल फ्री परख बँटवारा के अंत में Chromatin Decondensation अध्ययन करने के लिए
Summary
The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.
Abstract
During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.
Introduction
Xenopus laevis अंडे निकालने के एक सेल मुक्त परख की सादगी में जटिल सेलुलर घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली और व्यापक रूप से लागू उपकरण है। Lohka और Masui 1 से उनकी पहली वर्णन के बाद से वे बड़े पैमाने पर इस तरह के क्रोमेटिन संक्षेपण 2, धुरी विधानसभा 3, परमाणु लिफाफा टूटने 4, लेकिन यह भी nucleocytoplasmic परिवहन 5 या डीएनए प्रतिकृति के रूप में 6 mitotic प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस तरह के परमाणु लिफाफा सुधार और परमाणु ताकना जटिल दुबारा जोड़ना रूप interphasic नाभिक के सुधार के लिए आवश्यक बँटवारा के अंत में हो रही घटनाओं, जल्दी mitotic घटनाओं की तुलना में समझ बहुत कम कर रहे हैं, लेकिन इसी तरह Xenopus अंडे निकालने 7 का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है। हमने हाल ही में बँटवारा 8 के अंत में क्रोमेटिन decondensation अध्ययन करने के लिए Xenopus अंडे निकालने पर आधारित एक परख की स्थापना की है, एक के तहत जांच की प्रक्रिया मैं इंतजार कर रहा है किविस्तृत लक्षण वर्णन टीएस।
मेटाजोअन में, क्रोमेटिन अत्यधिक आनुवंशिक सामग्री की ईमानदारी से अलगाव प्रदर्शन करने के क्रम में mitotic प्रविष्टि पर सघन है। क्रोमेटिन अंतरावस्था दौरान जीन अभिव्यक्ति और डीएनए प्रतिकृति के लिए सुलभ है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, यह बँटवारा के अंत में डी-जमा होने की जरूरत है। रीढ़ में, क्रोमेटिन अप करने के लिए, mitotic संघनन आमतौर पर बहुत कम है जहां खमीर के विपरीत, एस में जैसे, केवल दो गुना अंतरावस्था 9 की तुलना में बँटवारा के दौरान और अधिक ठोस पचास गुना है cerevisiae 10। कशेरुकी क्रोमेटिन decondensation ज्यादातर अंडे के निषेचन के बाद शुक्राणु डीएनए पुनर्गठन के संदर्भ में अध्ययन किया गया है। एक आणविक तंत्र, जो nucleoplasmin, एक प्रचुर मात्रा में डिम्बाणुजनकोशिका प्रोटीन में, अंडे में संग्रहीत histones H2A और H2B के लिए शुक्राणु विशेष protamines बाजारों। इस प्रक्रिया को भी Xenopus अंडे निकालने 11, 12 का उपयोग करते हुए स्पष्ट किया गया था। हालांकि, अभिव्यक्तिnucleoplasmin के इन शुक्राणु विशेष protamines शामिल नहीं है oocytes 13 और mitotic क्रोमेटिन तक सीमित है। इसलिए बँटवारा के अंत में decondensation chromatin 8 स्वतंत्र nucleoplasmin है।
इन विट्रो decondensation प्रतिक्रिया के लिए हम सिंक्रनाइज़ हेला कोशिकाओं से अलग सक्रिय एक्स laevis अंडे और क्रोमेटिन समूहों से उत्पन्न निकालने रोजगार। एक कैल्शियम ionophore के साथ अंडे का उपचार निषेचन के दौरान शुक्राणु प्रवेश द्वारा उत्पन्न डिम्बाणुजनकोशिका में कैल्शियम रिहाई mimics। कैल्शियम लहर पहले अंतरावस्था 14 की प्रगति, अर्धसूत्रीविभाजन के दूसरे metaphase में गिरफ्तार सेल चक्र बहाली और अंडा, हो सके। इसलिए, प्रपत्र सक्रिय अंडे तैयार अंडा अर्क mitotic बाहर निकलें / अंतरावस्था राज्य का प्रतिनिधित्व करते हैं और क्रोमेटिन decondensation, परमाणु लिफाफे की तरह mitotic बाहर निकलने के लिए विशिष्ट घटनाओं के लिए प्रेरित करने में सक्षम हैं और जटिल सुधार ताकना। Mitotic चर्चा के अलगाव के लिएसमूहों romatin हम गुणसूत्र समूहों हेला कोशिकाओं बँटवारा में सिंक्रनाइज़ और ढाल centrifugations द्वारा polyamine युक्त बफ़र्स में अलग से सेल द्वारा जारी किया जाता है, जहां Gasser और Laemmli 15, द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल का एक थोड़ा संशोधित संस्करण का इस्तेमाल किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus अंडे अर्क ईमानदारी से इन विट्रो में सेलुलर प्रक्रियाओं को पुन: पेश करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण हैं laevis, और इस प्रणाली को सफलतापूर्वक सेल चक्र और कोशिका विभाजन घटनाओं 2, 3,5,6,17 के …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अक्स 1 और 2 विकासात्मक सेल 31 (3), Magalska से reprinted रहे हैं चित्रा के लिए यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन और ईआरसी (वाशिंगटन के लिए AN377 / 3-2 और 309,528 CHROMDECON) और बोहरिंगर Ingelheim फॉंड्स की एक पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया एट अल। बँटवारा, 305-318, 2014 के अंत में क्रोमेटिन decondensation में, RuvB-तरह ATPases समारोह, एल्सेविअर से रज़ामंदी के साथ।
Materials
| spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
| spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
| high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
| 37 % formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
| trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinin | Roth | A162.3 | |
| Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
| heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogenizer (40 mL tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
| L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
| syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
| creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
| centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL) | Biozym | 729065 | |
| 50 % glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 mL | toxic |
| 0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 mL | |
| flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL) | Biozym | 729055 | |
| 12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |
Riferimenti
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