셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기
Summary
The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.
Abstract
During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.
Introduction
Xenopus의 laevis의 달걀 추출물은 무 세포 분석의 단순 복잡한 세포 이벤트를 연구하는 강력하고 광범위하게 적용되는 도구입니다. Lohka & Masui 1에 의해 처음으로 설명하기 때문에 그들은 광범위하게 같은 염색질 응축 2, 스핀들 조립 3, 핵 봉투 고장 4뿐만 아니라 nucleocytoplasmic 전송 5 DNA 복제 (6) 등의 유사 분열 과정을 연구하는 데 사용되었다. 핵 봉투 개혁과 핵 기공 복잡한 재 조립 등의 interphasic 핵의 개혁에 필요한 유사 분열의 끝에서 발생하는 이벤트는, 초기 유사 분열 이벤트에 비해 이해 훨씬 덜하지만 유사 Xenopus의 계란 추출물 (7)를 사용하여 공부하실 수 있습니다. 우리는 최근에 유사 분열 (8)의 끝에서 염색질 decondensation을 연구하기 위해 Xenopus의 계란 추출물을 기반으로 분석을 설립, 언더 조사 과정은 내가 기다리고 그자세한 특성의 TS.
후생 동물에서 염색질은 높은 유전 물질의 분리를 충실히 수행하기 위해 유사 분열 진입 집광된다. 염색질은 간기 동안 유전자 발현과 DNA 복제를 위해 액세스 할 수 있는지 확인하기 위하여, 유사 분열의 끝에서 압축 해제 될 필요가있다. 척추 동물에서, 염색질은 최대 유사 분열 다짐 보통 훨씬 낮은 효모 달리, S. 예에서, 단지 두 배 계면 (9)에 비해 유사 분열 동안 더 괴성 오십 배이며 cerevisiae의 10. 척추 염색질 decondensation은 대부분 계란 수정 후 정자의 DNA 구조 조정의 맥락에서 연구되어왔다. 분자 메커니즘은 어떤 nucleoplasmin, 풍부한 난자 단백질, 계란에 저장 히스톤의 H2A와 H2B에 정자 별 프로타민을 교환한다. 이 과정은 또한 Xenopus의 계란 추출물 11, 12를 이용하여 규명 하였다. 그러나, 발현nucleoplasmin의이 정자 별 프로타민을 포함하지 않는 난 모세포 (13)과 유사 분열 염색질로 제한됩니다. 따라서 유사 분열의 끝에서 decondensation을 염색질 8 개의 독립적 인 nucleoplasmin입니다.
체외 decondensation 반응을 위해 우리는 동기화 된 HeLa 세포에서 분리 된 활성화 된 X를 laevis의 달걀과 염색질 클러스터에서 발생 추출물을 사용합니다. 칼슘 이온 운반체와 계란의 치료는 수정시 정자의 항목에 의해 생성 된 난자에 칼슘 방출을 모방. 칼슘 웨이브 제 상간 14로 이행, 감수 분열의 중기 제 체포 세포주기 재개와 달걀을 트리거한다. 따라서, 양식 활성화 계란 준비 계란 추출물은 유사 분열 출구 / 계면 상태를 나타내고 염색질 decondensation, 핵 봉투와 같은 유사 분열 종료에 대한 특정 이벤트를 유도 할 능력이 복잡한 개혁 기공. 유사 분열 채널의 분리를위한클러스터 romatin 우리는 염색체 클러스터가 헬라 세포 유사 분열에 동기화 및 그라데이션 회 원심에 의해 폴리아민 포함하는 버퍼에 격리에서 용해에 의해 방출된다 가세 & 램 믈리 15 일 발표 한 프로토콜의 약간 수정 된 버전을 사용했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제노 계란 추출물 충실히 시험 관내 세포 과정을 재현하는 매우 유용한 도구이다 laevis의,이 시스템은 성공적으로 세포주기 및 세포 분열 이벤트 2, 3,5,6,17의 특성화에 사용 하였다. 때문에 oogenesis 동안 계란에서 압수 핵 구성 요소의 대형 상점, 계란 추출물은 세포 성분의 훌륭한 소스입니다. 포유 동물 조직 세포주 또는 유전자 조작에 RNAi를 같은 다른 방법에 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AKS 1 & 2가 발달 셀 (31) (3), Magalska에서 다시 인쇄되어 그림에이 작품은 독일 연구 재단과 ERC (WA에 AN377 / 3-2 309528이 CHROMDECON)와 베링거 인 겔 하임 퐁의 박사 원정대에 의해 지원되었다 등의 등. 유사 분열, 305-318, 2014 년 말에 염색질 decondensation에서, RuvB 같은 -ATPase를 기능, 엘스 비어의 종류 권한.
Materials
| spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
| spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
| high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
| 37 % formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
| trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinin | Roth | A162.3 | |
| Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
| heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogenizer (40 mL tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
| L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
| syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
| creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
| centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL) | Biozym | 729065 | |
| 50 % glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 mL | toxic |
| 0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 mL | |
| flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL) | Biozym | 729055 | |
| 12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |
Riferimenti
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
- Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
- Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
- Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
- Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
- Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
- Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
- Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
- Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
- Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
- Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
- Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
- Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
- Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
- Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
- Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
- Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).
