En Cell Gratis analysen å studere Chromatin Decondensation på slutten av Mitosen

Summary

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Abstract

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

Introduction

Xenopus laevis egg ekstrakt er en kraftig og mye brukt verktøy for å studere kompliserte cellulære hendelser i enkelhet i en celle-fri analysen. Siden sin første beskrivelsen av Lohka & Masui ^en de har vært mye brukt til å studere mitotiske prosesser som kromatin kondens ^2, spindelenheten ^3, kjernekraft konvolutt sammenbrudd ^4, men også nucleocytoplasmic transport ⁵ eller DNA replikasjon ^6. De hendelser som finner sted i slutten av mitose, nødvendige for reformasjon av den interphasic kjernen som kjernekraft konvolutt reformasjon og kjernefysisk pore kompleks sammensetting er mye mindre forstått i forhold til de tidlige mitotiske hendelser, men kan være like studert ved hjelp Xenopus egg ekstrakt ^7. Vi har nylig etablert et assay basert på Xenopus egg ekstrakt for å studere kromatin decondensation ved slutten av mitose ^8, en under-prosess undersøkt som venter its detaljert karakterisering.

I metazoans er kromatin høyt kondensert ved mitotisk oppføring for å utføre trofast segregering av det genetiske materialet. For å sikre at kromatin er tilgjengelig for genekspresjon og DNA-replikasjon under interfase, må det være de-komprimeres i enden av mitose. I virveldyr, er kromatin opptil femti ganger mer komprimert i løpet av mitose i forhold til inter ^9, i motsetning til gjær hvor den mitotiske komprimeringen er vanligvis langt lavere, for eksempel bare to ganger i S. cerevisiae ^10. Virveldyr kromatin decondensation har vært mest studert i sammenheng med sperm DNA omorganisering etter egg befruktning. En molekylære mekanismen, der nucleoplasmin, en rikelig eggcelle protein, utveksler sperm spesifikke protaminer til histoner H2A og H2B lagret i egget. Denne prosessen ble også belyst ved hjelp Xenopus egg ekstrakt ^{11, 12.} Med uttrykketav nucleoplasmin er begrenset til oocytter ^{13 og} mitotisk kromatin ikke inneholder disse sperm spesifikke protaminer. Derfor kromatin decondensation på slutten av mitose er nucleoplasmin uavhengig ^8.

For in vitro decondensation reaksjon ansetter vi ekstrakt generert fra aktiverte X. laevis egg og kromatin klynger isolert fra synkroniserte HeLa celler. Behandling av egg med en kalsiumionofor ligner kalsium slipper inn i eggcelle generert av sperm oppføring under befruktning. Kalsium bølge utløser cellesyklusen gjenopptakelse og egget, arrestert i den andre metafase av meiose, utvikler seg til den første inter ^14. Derfor egg ekstrakter fremstilt skjema aktivert egg representerer mitotisk exit / inter staten og er kompetente til å fremkalle hendelser spesifikke for mitotisk exit som kromatin decondensation, kjernekraft konvolutt og pore kompleks reformasjon. For isolering av mitotisk chromatin klynger vi brukte en litt modifisert versjon av protokollen publisert av Gasser og Laemmli ^15, hvor kromosom klynger blir frigjort ved lysis fra HeLa-celler synkronisert i mitose, og isoleres i polyamin inneholdende buffere graderte sentrifugeringer.

Protocol

Mitotisk Chromatin Cluster Isolasjon fra HeLa celler 1. Forberedelser Cell Kultur Solutions Forbered fullstendig Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med tilsetning av 10% kalvefosterserum, 100 enheter / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 2 mM glutamin i DMEM. Forbered fosfatbuffer saltvann (PBS) inneholdende 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, 10 mM Na HPO 2 4 2 H 2 O og 2 mM KH 2PO 4 …

Representative Results

Tidsavhengigheten av decondensation reaksjonen Figur 1 viser et typisk tidsforløp for decondensation analysen. Klyngen av kromosomer synlige på begynnelsen av reaksjonen decondenses og går over i et enkelt, rund og glatt kjerne. Når egget ekstrakt er erstattet med sukrose-buffer kromosomet klyngen forblir kondensert, noe som tyder på at decondensation-aktivitet er tilstede i egget ekstrakt. Kromatin decondensation er en energiavhengig proses…

Discussion

Xenopus laevis egg ekstrakter er et svært nyttig verktøy for å gjengi cellulære prosesser in vitro, og dette systemet ble brukt i karakterisering av cellesyklus og celledeling hendelser ^{2, 3,5,6,17.} På grunn av store lagre av kjernekomponentene deponeres i egget under oogenesen, egg ekstrakter er en utmerket kilde til cellulære komponenter. Sammenlignet med andre fremgangsmåter som RNAi i mammalske vev cellelinjer eller genetisk manipulasjon, det gir flere fordeler: Det cel…

Materials

spermine tetrahydrochloride	Fluka analytical	85610-25G
spermidine trihydrochloride	Sigma	S2501-5G
high-purity digitonin	Millipore	300410-1GM	toxic
PMSF	Applichem	A0999,0100	toxic
thymidine	Calbiochem	6060
nocodazole	Calbiochem	487928	toxic
37 % formaldehyde solution	Roth	7398-1	toxic
trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	toxic
1,4-dithiothreitol (DTT)	Roth	6908.2
AEBSF hydrochloride	Applichem	A1421,0001
pepstatin	Roth	2936.1/2/3
leupeptin	Roth	CN334
aprotinin	Roth	A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution)	GE Healthcare	17-0891-01
glutamine	Gibco	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
75 cm² tissue culture flasks	Greiner Bio-one	658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10500-064
Homogenizer (40 mL tissue grinder)	Wheaton	357546
Neubauer chamber	Assistent	441/1
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)	Nalgene	3118-0050
100 µm cell strainer, nylon	BD Falcon	352360
cytochalasin B	Applichem	A7657,0010	toxic
cycloheximide	Roth	8682.3	toxic
L-cystein	Merck	1,028,381,000
hCG available as Ovogest	MSD	1431593
PMSG available as Intergonan	MSD	1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)	Enzo	ALX-450-002-M010	toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")	Braun	4665120
ATP	Serva	10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20	Roth	K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt	Calbiochem	2380
creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
DMAP	Sigma	D2629-1G
DAPI	Roche	10236276001
PFA	Sigma	P-6148	toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)	Beckman Coulter	343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL)	Biozym	729065
50 % glutaraldehyde solution, grade I	Sigma alderich	G7651-10 mL	toxic
0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution	Sigma	P8920-100 mL
flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm)	Greiner Bio-one	145211
Vectashield mounting medium	Vector laboratories	H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)	Beckman Coulter	343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL)	Biozym	729055
12 mm coverslips	Thermo Scientific	0784 #1