Emulsiones agua en aceite: Un nuevo sistema para el ensamblaje de las proteínas de unión de clorofila-solubles en agua con pigmentos hidrófobos
Summary
Este manuscrito describe un método simple y de alto rendimiento para el montaje de las proteínas solubles en agua con pigmentos hidrófobos que se basa en las emulsiones de agua-en-aceite. Se demuestra la eficacia del método en el montaje de las clorofilas nativas con cuatro variantes de soluble en agua-clorofila recombinante de unión a proteínas (WSCPs) de las plantas de Brassica expresan en E. coli.
Abstract
Clorofilas (Chls) y bacterioclorofilas (Bchls) son los co-factores principales que llevan a cabo la recolección de luz fotosintética y de transporte de electrones. Su funcionalidad depende críticamente de su organización específica dentro de los complejos de proteínas de múltiples subunidades transmembrana grandes y elaborados. A fin de comprender a nivel molecular cómo estos complejos facilitan la conversión de energía solar, es esencial para comprender la proteína de pigmento, y las interacciones de pigmento en pigmentos, y su efecto sobre la dinámica excitados. Una forma de obtener este entendimiento es mediante la construcción y el estudio de complejos de Chls con proteínas recombinantes simples solubles en agua. Sin embargo, la incorporación de los Chls lipófilos y Bchls en proteínas solubles en agua es difícil. Por otra parte, no existe un método general, que podría ser utilizado para el montaje de las proteínas solubles en agua con pigmentos hidrófobos. Aquí, demostramos un sistema simple y rendimiento alto a base de emulsiones de agua en aceite, que permite culoembly de las proteínas solubles en agua con Chls hidrófobos. El nuevo método fue validado mediante el ensamblaje de las versiones recombinantes de la proteína de unión a la clorofila soluble en agua de plantas Brassicaceae (PCSW) con Chl a. Demostramos el montaje exitoso de Chl a utilizando lisados crudos de E. expresan PCSW células coli, que puede utilizarse para el desarrollo de un sistema de pantalla genética para nuevas proteínas de unión a Chl solubles en agua, y para el estudio de interacciones proteína-Chl y procesos de montaje.
Introduction
pigmentos hidrófobos tales como las clorofilas (Chls), bacterioclorofilas (Bchls) y los carotenoides son los cofactores primarios en los centros de reacción fotosintéticos y proteínas de recolección de luz que llevan a cabo el transporte de electrones, y la captura de energía de la luz y la transferencia. Los centros de reacción y la mayor parte de los complejos de recolección de luz Chl-de unión son proteínas transmembrana. La proteína Fenna-Matthews-Olson (FMO) de la bacteria fotosintética verde-azufre no oxigénica 1,2, y la proteína peridinina-Chl (PCP) de dinoflagelados 3 son ejemplos excepcionales de proteínas solubles en agua captadores de luz. La unión de clorofila proteínas solubles en agua (WSCPs) de Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae y plantas Amaranthaceae 4, 5 son otro ejemplo único, sin embargo, en contraste con FMO y el PCP, éstos no son ni involucrarse en recolección de luz ni en ninguna de la reacción fotosintética primaria y su grafía precisasiological funciones todavía no están claros 5-8. Su alta afinidad de unión a Chl han dado lugar a una función sugerido como portadores transitorios de Chls y derivados de Chl 9,10. Alternativamente, se planteó la hipótesis de que PCSW juega un papel en los basureros Chls en las células dañadas y protege contra el daño foto-oxidativa inducida por Chl 7,11-13. Más recientemente, se sugirió que las funciones PCSW como un inhibidor de la proteasa y desempeña un papel en la resistencia herbívoro, así regula la muerte celular durante el desarrollo de la flor 14. WSCPs se dividen en dos clases principales de acuerdo con sus propiedades fotofísicas. La primera clase (clase I, por ejemplo. De Chenopodium album) puede someterse a fotoconversión tras la iluminación. WSCPs Clase II de las plantas del género Brassica, que no sean objeto de fotoconversión 5,10, se subdividen en la clase IIa (por ejemplo., De Brassica oleracea, Raphanus sativus) y IIb (por ejemplo., De Lepidium virginicum </em>). La estructura de clase IIb PCSW de Lepidium virginicum fue resuelto por cristalografía de rayos X a una resolución de 2,0 Å 8. Revela un homotetrámero simétrica en la que las subunidades de la proteína forman un núcleo hidrófobo. Cada subunidad se une una sola Chl que se traduce en una disposición apretada de cuatro Chls estrechamente empaquetados dentro de los core.This sencilla todo disposición Chl hace WSCPs un sistema modelo potencialmente útil para el estudio de unión y ensamblaje de complejos Chl-proteína, y los efectos de la vecina Chls y entornos de proteínas en las propiedades espectrales y electrónicas de Chls individuales. Además, se puede proporcionar plantillas para la construcción de proteínas de unión a Chl artificiales que pueden ser utilizados para los módulos de captación de luz en dispositivos fotosintéticos artificiales.
Estudios rigurosos de WSCPs nativos no son factibles debido a que los complejos purificados de plantas siempre contienen una mezcla heterogénea de tetrámeros con diferentes combinaciones de Chl ay Chl b 9. Por lo tanto, se requiere un método para el montaje de WSCPs expresadas de forma recombinante con Chls in vitro. Este es desafiada por la insignificante solubilidad en agua de Chls que hace imposible ensamblar el complejo in vitro mezclando simplemente las apoproteínas solubles en agua con pigmentos en soluciones acuosas. Ensamblaje in vitro mediante la mezcla de las apoproteínas con membranas tilacoides 15 se demostró, pero este método se limita a la nativa Chls presente en los tilacoides. Schmidt et al. informaron sobre el montaje de varios derivados de Chl y BChl con PCSW de la coliflor (CaWSCP) mediante la expresión de una proteína recombinante marcado con histidina en E. coli inmovilizándolo en una columna de Ni-afinidad y la introducción de derivados de Chl solubilizan en detergentes 11. Con éxito la reconstitución de WSCPs recombinantes a partir de A. 6 thaliana, y las coles de Bruselas (BoWSCP), rábano japonés salvaje (RshWSCP) unaTambién se informó d Virginia pepperweed (LvWSCP) por un método similar.
A continuación, presentamos una novela, método general y directa para el montaje de Chls con PCSW que no requiere etiquetado o la inmovilización de las proteínas. Se basa en la preparación de emulsiones de sus soluciones acuosas de los apoproteínas solubles en agua en aceite mineral. Las proteínas se encapsulan por lo tanto en agua-en-aceite (W / O) microgotas con muy alta relación de superficie a volumen 16. Los cofactores hidrofóbicos se disuelven en el aceite y se introducen fácilmente en las gotitas de la fase de aceite. Se presenta sobre el uso del método para el montaje de varias variantes de apoproteínas PCSW recombinante expresadas en E. coli con Chl a. Se demuestra el conjunto de lisado crudo de bacterias PCSW sobreexpresan que pueden ser utilizados como un sistema de detección para el desarrollo de nuevas proteínas de unión de Chl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro objetivo era desarrollar un nuevo sistema general de ensamblaje de las proteínas de unión a la clorofila-solubles en agua con pigmentos hidrofóbicos. Aquí se demuestra que el nuevo sistema basado en la reconstitución de emulsión W / O es un enfoque general demostrado que funciona para el montaje de apoproteínas PCSW de las coles de Bruselas, coliflor, rábano picante japonés y pepperweed Virginia recombinante expresado en E. coli. Aquí se presentan los resultados de la reconstitución de 1 mg d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DN reconoce el apoyo de la UE 7PM proyectos PEPDIODE (GA 256 672) y REGPOT-2012-2013-1 (GA 316 157), y una beca de investigación personal (Nº 268/10) de la Fundación de Ciencias de Israel. Agradecemos al Prof. Shmuel Rubinstein, Facultad de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE.UU. para la toma de las imágenes de microscopía confocal.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
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