Vand i olie Emulsioner: Et nyt system til samling Vandopløselige klorofyl-bindende proteiner med Hydrofobe Pigmenter
Summary
Dette håndskrift beskriver en enkel og høj-throughput fremgangsmåde til samling vandopløselige proteiner med hydrofobe pigmenter, der er baseret på vand-i-olie emulsioner. Vi viser effektiviteten af fremgangsmåden til samling af native chlorophyller med fire varianter af rekombinant vandopløseligt-klorofyl proteiner (WSCPs) af Brassica planter udtrykt i E. coli.
Abstract
Chlorophyll (Chl'er) og bakteriochlorophyler (Bchl'er) er de primære cofaktorer, der udfører fotosyntetiske lys høst og elektron transport. Deres funktionalitet kritisk afhænger af deres specifikke organisation inden for store og kunstfærdige multisubunit transmembrane protein komplekser. For at forstå på molekylært niveau, hvordan disse komplekser lette solenergi konvertering, er det vigtigt at forstå protein-pigment, og pigment-pigment-interaktioner, og deres virkning på ophidset dynamik. En måde at få en sådan forståelse er ved at konstruere og studere komplekser af Chl'er med enkle vandopløselige rekombinante proteiner. Imidlertid omfatter de lipofile Chl'er og Bchl'er til vandopløselige proteiner er vanskelig. Desuden er der ingen generel fremgangsmåde, der kan anvendes til samling af vandopløselige proteiner med hydrofobe pigmenter. Her udviser vi en enkel og højt gennemløb baseret på vand-i-olie emulsioner, som muliggør røvembly af vandopløselige proteiner med hydrofobe Chl'er. Den nye metode blev valideret ved samling af rekombinante versioner af den vandopløselige klorofyl bindingsprotein af Brassicaceae planter (WSCP) med Chl a. Vi viser den vellykkede samling af Chl en bruger rå lysater af WSCP udtrykker E. coli-celle, som kan bruges til at udvikle en genetisk screen system til hidtil ukendte vandopløselige Chl-bindende proteiner, og til undersøgelser af Chl-protein interaktioner og samleprocesser.
Introduction
Hydrofobe pigmenter såsom chlorophyller (Chl'er), bakteriochlorophyler (Bchl'er) og carotenoider er de primære cofaktorer i fotosyntetiske reaktion centre og lette høst proteiner, der udfører elektron transport, og lysenergi opsamling og overførsel. Reaktionsbetingelserne centre og de fleste af de Chl-bindende lette høst komplekser er transmembrane proteiner. Den Fenna-Matthews-Olson (FMO) protein af ikke-oxy- fotosyntetiske grønne svovlbakterier 1,2, og peridinin-Chl protein (PCP) af dinoflagellater 3 er ekstraordinære eksempler på vandopløselige lys høst proteiner. De vandopløselige klorofyl bindende proteiner (WSCPs) af Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae og Amaranthaceae planter 4, 5 er en anden enestående eksempel, men i modsætning til FMO og PCP, disse er hverken involveret i lys høst eller i nogen af de primære fotosyntetiske reaktion og deres præcise grafisiological funktioner er endnu uklart 5-8. Deres høje Chl-bindende affinitet har ført til en foreslået funktion som forbigående bærere af Chl'er og Chl derivater 9,10. Alternativt blev det hypotese, at WSCP spiller en rolle i indfangning Chl'er i beskadigede celler og beskytter mod Chl-induceret photooxidative skade 7,11-13. For nylig blev det foreslået, WSCP fungerer som en proteaseinhibitor og spiller en rolle under planteæder resistens samt regulerer celledød under blomst udvikling 14. WSCPs er opdelt i to hovedklasser efter deres fotofysiske egenskaber. Den første klasse (klasse I, f.eks. Fra Chenopodium album) kan undergå fotokonvertering på belysning. Klasse II WSCPs fra Brassica planter, der ikke undergår fotokonvertering 5,10, er yderligere opdelt i klasse IIa (f.eks. Fra Brassica oleracea, Raphanus sativus) og IIb (f.eks. Fra Lepidium virginicum </em>). Strukturen i klassen IIb WSCP fra Lepidium virginicum blev løst ved røntgenkrystallografi på 2,0 Å opløsning 8. Det afslører en symmetrisk homotetramer hvor proteinet underenheder danner en hydrofob kerne. Hver underenhed binder et enkelt Chl som resulterer i en stram arrangement af fire tæt pakkede Chl'er inden for de core.This simpel alle Chl arrangement gør WSCPs et potentielt nyttigt modelsystem til undersøgelse binding og samling af Chl-protein-komplekser, og virkningerne af tilstødende Chl'er og protein miljøer på de spektrale og elektroniske egenskaber af individuelle Chl'er. Endvidere kan det give skabeloner til konstruktion af kunstige Chl-bindende proteiner, der kan anvendes til let høst moduler i kunstige fotosyntetiske enheder.
Grundige undersøgelser af native WSCPs ikke er mulig, fordi komplekserne oprenset fra planter altid indeholde en heterogen blanding af tetramerer med forskellige kombinationer af Chl aog Chl B 9. Således kræves der en fremgangsmåde til samling rekombinant udtrykt WSCPs med Chl'er in vitro. Dette udfordres af den ubetydelige vandopløselighed Chl'er hvilket gør det umuligt at samle komplekset in vitro ved simpelthen at blande de vandopløselige apoproteiner med pigmenter i vandige opløsninger. In vitro samling ved blanding af apoproteiner med thylakoid membraner 15 blev påvist, men denne fremgangsmåde er begrænset til det native Chl'er stede i thylakoider. Schmidt et al. rapporteret om at samle flere Chl- og BChl derivater med WSCP fra blomkål (CaWSCP) ved rekombinant udtrykker et histidin-mærket protein i E. coli immobilisere det på en Ni-affinitetssøjle og indføre Chl- derivater solubiliseret i vaskemidler 11. Succesfuld rekonstitution af rekombinante WSCPs fra A. thaliana 6, og rosenkål (BoWSCP), japansk kiddike (RshWSCP) etd Virginia pepperweed (LvWSCP) ved en lignende metode blev også rapporteret.
Her præsenteres en roman, generelt enkel metode til samling Chl'er med WSCP, der ikke kræver tagging eller immobilisere proteinerne. Den er afhængig af at forberede emulsioner fra deres vandige opløsninger af de vandopløselige apoproteiner i mineralolie. Proteinerne er således indkapslet i vand-i-olie (W / O) mikrodråber med meget højt overfladeareal til volumenforhold 16. De hydrofobe cofaktorer derefter opløst i olien og kan let indføres i de små dråber fra oliefasen. Vi rapporterer om anvendelse af metoden til samling af flere varianter af WSCP apoproteiner rekombinant udtrykt i E. coli med Chl a. Vi viser samlingen fra råt lysat af WSCP overudtrykker bakterier, som kan anvendes som en screening system for udvikling af hidtil ukendte Chl- bindende proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores mål var at udvikle et nyt generelt system til samling af vandopløselige klorofyl-bindende proteiner med hydrofobe pigmenter. Her er det vist, at det nye rekonstituering baseret på W / O-emulsion er en generel indstilling vist sig at arbejde til samling af WSCP apoproteiner fra rosenkål, blomkål, japansk peberrod og Virginia pepperweed rekombinant udtrykt i E. coli. Her er præsenteret fra rekonstituering af 1 mg WSCP med 10-fold molært overskud af Chl a. Men det er også muligt at anvende l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DN anerkender støtte fra EU FP7-projekter PEPDIODE (GA 256.672) og REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), og en personlig forskningsbevilling (nr 268/10) fra Israel Science Foundation. Vi takker Prof. Shmuel Rubinstein, School of Engineering og Applied Sciences, Harvard University, Cambridge MA, USA for at træffe de konfokale mikroskopi billeder.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
Riferimenti
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochimica. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA – Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
